[发明专利]从微量酒精溶液保存样品中快速提取高浓度DNA的方法

说明书

本发明公开了从微量酒精溶液保存的样品中提取高浓度DNA的方法。通过10%甘油溶液37°C浸泡样品10min，再纯水洗涤1遍后，采用组织裂解液55°C裂解1小时后加入2倍裂解液体积的纯水后，加入3倍裂解液体积的提纯液混匀5min后6000rpm离心5min，将上清液移入新1.5ml离心管中加入沉淀试剂4°C沉淀2h后13000rpm常温离心5 min弃上清，加入1.0ml 70%乙醇洗涤2min，13000rpm离心5min后弃上清，自然风干后加入30μl无菌水溶解DNA。本方法能够得到操作方便、简单，能够得到满足后续PCR扩增的高浓度DNA。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从微量酒精溶液保存样品中快速提取高浓度DNA的方法。

背景技术

提取足够量的合格DNA是进行后续多种分子生物学分析的重要基础。尽管目前已有多种DNA提取方法，并且这些方法大都能够得到满足后续实验要求的DNA质量，如机械破碎或化学裂解细胞后通过吸附柱纯化得到高纯度的DNA样品，再如机械破碎或化学裂解细胞后通过酒精和盐沉淀法得到高浓度的DNA样品。这些方法得到的DNA样品均可以满足后续PCR扩增等实验需求。

然而，以上方法大都要求样品重量至少要在0.1 g以上，且最好为-20°C或-80°C冷冻保存的样品。但是，在野外采集样品时，往往很难做到-20°C或-80°C冷冻保存样品，而是采用70%酒精溶液或浓度更高的酒精溶液保存样品。浓度为70%以上的酒精溶液保存的样品因为酒精引起的脱水，会使保存的组织样品变硬且更加柔韧，不利于后续的组织破碎；并且酒精本身会对蛋白酶活性造成影响，也增大了化学裂解细胞的难度，从而最终降低了DNA的提取效率。

尽管对于较大的组织，因DNA含量较多，虽然DNA的提取效率偏低并不会对DNA的产量和后续的分析造成太大的影响，但是如果对酒精溶液保存的微量生物样品进行DNA提取，较低的提取效率往往会造成DNA产量不足而无法开展后续的实验分析。比如，对繁殖时期特定生境的鱼卵或仔鱼的数量及种类进行调查是评估渔业资源补充能力和渔业资源现状、为后续有诊断性地开展渔业资源保护提供重要参考资料的常用技术手段。然而，由于鱼卵和仔鱼尚未发育完善，其用于物种分类的生物学特征不明显，因此难以进行物种鉴定。随着分子生物学技术的纵深发展和数据库中鱼类相关基因序列的不断补充完善，通过测序技术进行鱼卵和仔鱼物种鉴定成为可能,并被用于渔业资源补充能力的评估过程中。然而，由于鱼卵和仔鱼个体微小（通常不足0.05 g），为了防止腐烂，采集时通常采用70%或更高浓度的酒精溶液进行保存，这都为DNA提取带来了不便。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是从酒精溶液保存的微量样品中提取用于PCR扩增和DNA测序足够量的高浓度DNA样品。该方法流程简单、快速，操作简便，得到的DNA样品能够很好地满足后续PCR扩增和DNA测序分析需求。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

将酒精溶液保存的组织样品放入2ml灭菌离心管中，加入1ml的10%甘油溶液37°C 浸泡10 min；用1 ml微量移液器将洗涤后的甘油溶液移除后再加入1 ml纯水洗涤2 min，去除洗涤后的纯水。

按0.1 g组织加入100 μl组织裂解液的比例加入组织裂解液，然后按100 μl裂解液加入1 μl浓度为20 mg/ml的蛋白酶K溶液，混匀后放入55°C水浴锅中水浴1h，每20 min混匀一次。每100 ml所述的组织裂解液含有10 ml浓度为1M、pH为8.0的Tris-HCl溶液、1 gSDS和3.7224 g EDTA·Na₂。

等组织完全裂解后，加入2倍组织裂解液的纯水后，加入3倍组织裂解液的24:1比例的氯仿:异戊醇提纯液，混匀5 min后6000 rpm常温离心5 min；将上清液转入1.5 ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 M浓度醋酸钠溶液组成的沉淀试剂，混匀后于4°C静置2 h后13000 rpm常温离心5 min后弃上清液。