[发明专利]一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开一种鸭呼肠孤病毒疫苗，其是在传代细胞系BHK‑21细胞上接种鸭呼肠孤病毒毒种得到的灭活疫苗。利用Reed‑Muench方法测定其病毒滴度可以稳定达到10^7.0‑10^7.5TCID50/0.1mL。抗原的稳定生产和高滴度是制备疫苗最关键因素,用BHK‑21细胞进行鸭呼肠孤病毒增殖其病毒滴度是常规鸭胚法及原代细胞法的10倍以上，如采用生物反应器进行病毒增殖，其病毒滴度可以达到100倍水平。本专利公开的鸭呼肠孤病毒灭活疫苗，产量高，品质稳定，免疫鸭能产生高水平血清中和抗体，免疫效果好，具有巨大的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种鸭呼肠孤病毒疫苗及其制备方法。

背景技术

我国自1997年起，在两广、浙、闽、豫和鄂等省爆发了以鸭肝脏上有白色坏死点为特征的病。本病在遇到混合感染或应激时死亡率非常高。通常，此病主要发生于7～45日龄番鸭，致病率高达20％～90％，死亡率为10～50％。感染鸭多表现为腹海，软脚，附关节或趾关节不同程度肿胀，耐过鸭变为僵鸭；剖检可见肝、脾、胰、肾和肠的坏死。此以肝脏不规则坏死、出血斑/点和心肌、腔上囊出血为主要特征的新疫病，俗称鸭新肝病、鸭坏死性肝炎病等，经分离鉴定其病原为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属鸭呼肠孤病毒。

目前尚没有鸭呼肠孤病毒疫苗上市，也没有相关的药物控制该病毒导致的疾病，鸭呼肠孤病毒感染疾病的发生常给养鸭业造成重大经济损失。

发明内容

本发明要解决的技术问题是有效预防鸭呼肠孤病毒。

为解决上述技术问题，本发明公开一种鸭呼肠孤病毒疫苗，其是在传代细胞系BHK-21 细胞上接种鸭呼肠孤病毒毒种得到的灭活疫苗。

所述鸭呼肠孤病毒疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

(1)BHK-21细胞的传代与培养：BHK-21细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成细胞单层时，用于继续传代或接种病毒；

(2)病毒的接种和培养：取已形成单层的上述细胞，弃去细胞生长液，接种细胞维持液，将呼肠孤病毒毒种按终体积1:100～1:1000接种到制备的细胞，吸附后吸弃病毒液，在用培养液培养至细胞出现病变时收获；

(3)病毒的收集、浓缩、纯化：将上述接种的病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液；通过超滤浓缩上述病毒液即为制苗病毒液；

(4)病毒灭活：采用0.1％福尔马林灭活病毒，即为疫苗抗原；

(5)使用疫苗抗原配置疫苗制剂。

优选所述步骤(1)中的细胞生长液为含5～10％新生牛血清的DMEM培养液,所述细胞生长液中可含双抗。所述步骤(2)所述细胞维持液为无血清的DMEM培养液，毒种接种到细胞后在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，接毒后在培养液中培养条件为37℃、5％CO2，所述培养液为含1～2％新生牛血清的DMEM培养液，细胞维持液中可含有2mM的谷氨酰胺，更优选含有0.2mM的N-N-二乙基-1-4-苯二胺。所述步骤(3)中所述制苗病毒液每0.1mL病毒大于含量10^7.0TCID₅₀。所述步骤(1)中BHK-21细胞在转瓶内或在微载体反应器中培养。

所述步骤(5)配置疫苗制剂包括如下步骤：

a)水相制备：取检验合格的疫苗抗原96份加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；

b)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司班-80 4份，先将白油缓慢加温，按4％和2％加入司班-80和硬脂酸铝，边搅边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌备用；

c)乳化：利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即可；