[发明专利]一种PD-L1外泌体的体外快速检测平台及检测方法

说明书

本发明公开了一种PD‑L1外泌体的体外快速检测平台及检测方法，属于快速检测技术领域。检测平台包括样品初滤区、纳滤区、显色物垫区、显色区和吸水垫区。所述显色区上的捕获抗体和显色物垫区上的显色物标记抗体中至少有一种为外泌体PD‑L1抗体。检测方法为先将待检样品经过初滤膜进行初步过滤，再经过纳滤膜进行过滤，得到外泌体；外泌体与显色物标记抗体特异性地结合，与显色物标记抗体特异性结合的外泌体再与捕获抗体结合，形成双抗体夹心；所述捕获抗体和显色物标记抗体至少有一种为外泌体PD‑L1抗体。此平台集成全血分离，外泌体纯化以及PD‑L1外泌体特异检测，具有操作方便，检测快捷，以及成本低等特点。

技术领域

本发明属于快速检测技术领域，具体涉及一种PD-L1外泌体的体外快速检测平台及检测方法。

背景技术

外泌体是细胞分泌到胞外微环境中的纳米级小囊泡(直径50-150nm)，在1983首次被发现。但由于分析手段的缺乏，长期以来外泌体被认为是细胞排泄胞内垃圾的工具。随着分析方法的不断创新，外泌体分泌的机制逐渐被揭示。现在，科学界主流的观点认为，外泌体主要参与细胞间的信号传递以及作为疾病标记物。2013年诺贝尔生理医学奖授予了揭示这一领域重大发现的三位杰出科学家。然而，由此引发的外泌体功能研究与未来潜在应用给国际学术界带来无限遐想。2015年，借助活体成像技术，外泌体等胞外膜泡在体内广泛传递获得证实；而更激动人心的发现，外泌体正颠覆科学界对癌症发育的认知：传统观点认为，肿瘤转移是由于原发灶肿瘤细胞通过血液循环系统直接落户到其他组织。这导致了时下循环肿瘤细胞研究盛况空前；在正常情况下，T细胞鉴别到癌细胞后使癌细胞自动裂解，维持人体的平衡。但是癌细胞表面表达一种特殊的蛋白质(受体)，和T细胞结合，令T细胞产生“错觉”，认为癌细胞是“无害的”，同时使得T细胞的活性降低，癌细胞获得自救。这种特殊的蛋白质就是PD-L1(程序性死亡受体-1的配体)。但最新的外泌体分析发现，肿瘤是首先分泌外泌体作为先锋队，通过血液循环系统传送到其他组织，并改造微环境使其适应肿瘤细胞生长后，再排遣肿瘤细胞大军安营扎寨。这一发现再次刷新或颠覆了我们对癌症的认识，百年来关于癌症的“种子”和“土壤”假说终于获得印证。令人振奋的是，最近陈刚副教授在其研究中发现，肿瘤细胞可通过释放表面富含PD-L1的外泌体发挥对肿瘤杀伤性T细胞的功能抑制作用，且外周血中PD-L1阳性外泌体的浓度水平与肿瘤大小呈密切正相关(Nature,2018,560(7718):382-386)。因此，开发一种基于外泌体PD-L1蛋白的体外快速检测平台及方法，对于肿瘤无创诊断以及实时疗效检测，将具有重要的意义。文献检索发现，Blanco-López等人2016年就提出了一种基于试纸条的外泌体检测平台，简单有效，但其外泌体分离仍需超离，费时费力(Journal of Extracellular Vesicles 5(2016):3180；Biosensors andBioelectronics 87(2017):38–45)。检索专利发现，王国胜等人也提出了一种外泌体即时检测平台(申请号201811060763)，其中利用纳米芯片技术实现外泌体分离纯化，理论可行，但加工和操作复杂，分离芯片如何与试纸条整合也是难点。同时文献及专利中多数是基于检测外泌体表面的四跨膜超家族蛋白(CD63/CD9/CD81等)，正常细胞分泌的外泌体表面也携带四跨膜超家族蛋白，所以目前大多数外泌体检测目的是基于外泌体丰度检测，并不具有特异性。

发明内容

本发明解决了现有技术中外泌体检测特异性不高、操作不便以及成本高的技术问题。

按照本发明的第一方面，提供了一种PD-L1外泌体的体外检测平台，包括：

样品初滤区：所述样品初滤区上粘贴有初滤膜，所述初滤膜用于初步过滤样品，截留所述样品中直径大于初滤膜直径的细胞和/或颗粒物；

纳滤区：所述纳滤区与所述样品初滤区连接；所述纳滤区上粘贴有纳滤膜，所述纳滤膜用于分离得到外泌体；