[发明专利]一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用

说明书

本发明提供了一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用；本发明通过设计并验证得到特异性的引物组，基于引物组摸索验证检测体系，各步骤各条件相互配合，协同增持，使其检测结果稳定准确，检测步骤简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用。

背景技术

结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在各类癌症中发病率排名第三，致死率排名第四，近55％的发病案例发生在较发达国家。在年龄小于40岁的人中发生率较低，但随着年龄增加发生率亦逐渐增高。通常认为饮食习惯的西方化会增加CRC发病率，但目前美国及其他高收入国家发病率却保持稳定甚至下降，推测与乙状结肠镜检查及结肠镜下的息肉切除术的增加有关。结直肠癌也是目前最可预防的肿瘤之一，医学界认为如果及早发现，肠癌是最易治愈的癌症。传统的结直肠癌筛选方法主要是结肠镜检查，另外还有活体组织检查和脱落细胞学检查，这几种检查方法都是侵入式的，尤其是脱落细胞学检查取材繁琐，不易获得满意的标本，临床应用少。所以如果没有相关症状，很多人并不愿意去做结直肠癌的早期筛查。

哺乳动物的胃肠道密集地定殖有与其宿主以共生方式共存的数百种微生物物种，统称为微生物群的微生物影响众多的宿主健康方面，包括营养物代谢、肠组织的体内稳态、先天性和适应性免疫反应的发展，且更一般而言防御肠感染。细菌通过接触依赖性和可溶因子介导的抑制直接以及间接通过调节和诱导宿主免疫反应来拮抗肠道致病菌，但个别细菌对于定植抗特异性病原体的抗性的作用尚未充分了解。人体肠道微生物组包含了数量巨大的微生物，它们参与食物药物代谢、人体免疫调节，在保持人体健康中起着极其重要的作用。研究疾病的不同阶段中微生物组成分的改变能够作为一种新的用于癌症诊断及预后效果测试的手段。

因此，研发一种用于结直肠癌检测的微小微单胞菌引物组、检测体系及其应用，实现准确简便的检测，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足和市场的需求，本发明提供了一种检测微小微单胞菌的引物组及其检测体系和应用，通过设计特异性的引物并摸索反应浓度和条件，构建性能良好的检测体系和使用方便的试剂盒，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，一种检测微小微单胞菌的引物组，所述引物组包括微小微单胞菌引物对：SEQ ID NO.1-2。

优选地，所述引物组还包括总菌引物对：SEQ ID NO.3-4。

微生物16S rRNA序列包含9个可变区和10个高度保守区，本发明中，发明人为保证引物特异性，选择在保守区内设计引物，得到微小微单胞菌引物对；另外相对于其他可变区，V3-V4区能够覆盖98％以上的细菌，且V3-V4区扩增产物长度符合qPCR对引物预期产物的长度要求；以此为条件，设计得到一对符合要求的总菌引物，可以对粪便样本中的所有微生物的总量进行鉴定。

根据细菌名称在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nμccore/)上下载细菌的16S rRNA序列，而后利用引物设计软件Primer Primer 5设计细菌特异性引物；qPCR引物设计要求：引物长度18-25bp左右，避免产生二级结构，GC含量50-60％，Tm值60-65℃，产物长度100-250bp。所述特异性引物包括随机碱基，所述随机碱基的个数为3-5个，通过加入随机碱基，调控随机碱基的数量，提高检测特异性。