[发明专利]一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法

权利要求书

1.一种基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，所述基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法包括：

基于pESD-PPI质粒构建带有gfp和mCherry荧光基因的能进行Golden gate组装表达质粒pESD-PPI-GFP-mCherry；

从数据库UniProt上分别选择5对运动发酵单胞菌中相互作用的蛋白对和未被报道有相互作用的蛋白对分别作为分析运动发酵单胞菌中蛋白相互作用的正对照和负对照；

对分析结果进行量化，量化的公式：单荧光比例/(单荧光比例+双荧光比例)×100％；

表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry构建方法包括：

1)以F-1和R-1为引物，mCherry基因为模板扩增片段1；

2)以片段1为模板，F-2和R-2为引物扩增片段2；

3)以片段2为模板，F-3和R-2为引物扩增片段3；

4)以pESD-PPI为模板，F-4和R-3为引物扩增片段4；

5)以片段3和片段4为模板，F-3和R-3为引物扩增片段5；

6)用NdeI和SalI酶切载体pESD-PPI，获得酶切载体1；

7)利用Gibson装配试剂盒组装片段5和酶切载体1，转化大肠杆菌感受态，获得含mCherry的表达载体pESD-PPI-mCherry；

8)以pEZ15a-lacUV5-GFP为模板，F-5和R-4为引物扩增片段6；

9)以片段6为模板，F-5和R-5为引物扩增片段7；

10)以pESD-PPI为模板，F-6和R-6为引物扩增片段8；

11)以片段8和片段7为模板，F-6和R-5为引物扩增片段9；

12)用PstI和BamHI酶切载体pESD-PPI-mCherry，获得酶切载体2；

13)利用Gibson装配试剂盒组装片段9和酶切载体2，转化大肠杆菌感受态，获得含GFP和mCherry的表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry SEQ ID NO：5。

2.如权利要求1所述的基于YESS分析原核生物中蛋白相互作用的方法，其特征在于，表达载体pESD-PPI-GFP-mCherry构建方法进一步包括：

1)构建蛋白的表达载体：

与NH2-TEVF融合表达蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCaGCGC+基因上游引物；

R：GTGCTGGGTCTCcAGCA+基因下游引物；

与COOH-TEVF融合表达蛋白的基因引物：

F：agcgtgGGTCTCAGGCC+基因上游引物；

R：GTGCTGGGTCTCTGCCGCC+基因下游引物；

扩增基因片段，并纯化；

Golden gate组装载体和片段；体系：0.05mol基因片段,20ng pESD-PPI-GFP-mCherry，1μL T4 ligase buffer(Thermo)，0.2μL T4 ligase(Thermo)，0.3μL BsaI(NEB)，0.1μLBSA(Takara)；反应程序：37℃，3h；

转化大肠杆菌感受态；

挑取不发荧光的单菌落做菌体PCR，测序；

2)转化酵母EBY-100：

酵母划线活化；

挑取单菌落到1mL YPD培养基中过夜，30℃，220rpm；

第二天早上测量OD_600nm,加入适量YPD，将OD_600nm调到0.1；

30℃220rpm培养4-5h后，OD_600nm为0.4-0.6；

6000rpm离心2min，弃上清；

1mL无菌水洗一次，6,000rpm离心2min，1mL 0.1mol/L LiAc/TE洗一次，6,000rpm离心2min；

100μL 0.1mol/L LiAc重悬，20μL菌液+2μL质粒；

62.4μL 50％PEG3350；

8.23μL 1mol/L LiAc；

9.58μL DMSO；

5μL 50mg/mL ssDNA；

30℃培养箱30min-1h；

42℃水浴锅15min；

用200μL-1mL 5mmol/L CaCl₂洗一次，6,000rpm离心2min；

100μL 5mmol/L CaCl₂重悬，涂SD-UT平板；

3)酵母表面展示：

挑取单菌落至800μL SD-UT培养基中培养过夜；

转移合适的菌液于800μL SD-DT培养基中，使起始OD_600nm＝0.8；

取10⁶个细胞，用Buffer B洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清；

用150μL Buffer B洗一次，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清；

每个样品中加20μL Buffer B+0.15uL抗体，避光于4℃避光放置15min；

转到室温30min，避光；

取出样品，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清，用150uL的Buffer B洗一遍；

加入150μL Buffer C(1×PBS)重悬细胞，6000rpm，4℃，1min沉淀细胞，弃上清；

加300μL Buffer C重悬细胞，转移到2mL EP管中，流式细胞仪进行结果展示。