[发明专利]一种三疣梭子蟹几丁质酶基因及其重组表达蛋白和应用

说明书

本发明公开了一种三疣梭子蟹几丁质酶基因及其重组表达蛋白和应用。本发明通过进行三疣梭子蟹几丁质酶PtCht4基因克隆，利用PtCht4基因编码蛋白的核苷酸序列构建原核表达载体，筛选出一种能够高效表达三疣梭子蟹PtCht4基因重组蛋白的表达体系，通过蛋白纯化与复性获得能够正确折叠且具有活性的重组蛋白。本发明将重组蛋白用于体外抑菌，由于PtCht4基因属于三疣梭子蟹的内源基因，由此表达产出的蛋白制成的药物使机体不会产生排斥反应，且能够激发机体的非特异性免疫系统，降低细菌的耐药性，体外抑菌技术的实现可为蟹类新型药物的研究提供一种新的思路。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种三疣梭子蟹几丁质酶基因及其重组表达蛋白和应用。

背景技术

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、梭子蟹科、梭子蟹属，是我国重要的海水养殖品种，具有生长快、肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富等优点，是经济价值高的重要海产品。但随着养殖环境的不断恶化增加了蟹患病的可能性，很大程度上制约了蟹的发展，为减少外源药物的使用，实现生态养殖和追求利益最大化，三疣梭子蟹自身免疫防御能力的提高和有效的新型药物的研究就显得尤为重要。

几丁质酶(Chitinase)是一种广泛存在于节肢动物，可通过裂解病原菌细胞壁中几丁质(Chitin)从而发挥免疫功能的关键酶类。通过研究几丁质酶PtCht4基因的结构与功能，进而实现重组蛋白的体外抑菌。目前尚未见三疣梭子蟹几丁质酶基因体外抑菌的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种三疣梭子蟹几丁质酶基因的重组表达蛋白及其在体外抑菌中的应用，所述PtCht4基因的重组蛋白具有显著的抗菌作用，为增强三疣梭子蟹对病原菌的抵御能力提供了实验支持。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种三疣梭子蟹几丁质酶PtCht4基因，其核苷酸序列表如SEQ IDNO：1所示。

本发明还提供了所述的三疣梭子蟹几丁质酶PtCht4基因翻译产生的几丁质酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了所述的三疣梭子蟹几丁质酶PtCht4基因产生的重组表达蛋白，它的制备方法包括以下步骤：

(1)克隆几丁质酶基因；

(2)重组表达载体的构建：对几丁质酶基因进行开放阅读框的扩增，对PCR产物和pET-28a质粒进行双酶切，并进行PCR扩增，回收纯化产物，将连接体系和感受态细胞混合，加入培养基，涂板培养，以T7、T7teminator引物筛选目的菌株；

(3)重组蛋白的诱导表达：将目的菌株接种于培养基培养，转移到感受态细胞，将得到的菌株进行诱导表达；

(4)重组蛋白的分离纯化：将诱导表达成功后的菌株扩大培养，将得到的菌体加入裂解液，超声破碎后离心，得到以包涵体的形式在表达菌株中存在的目的蛋白，将包涵体洗涤、纯化；

(5)重组蛋白的复性：将纯化后的重组蛋白装入透析袋，依次用透析液透析，最后离心、取上清，得到重组表达蛋白。

进一步的：所述步骤(2)中双酶切采用分步酶切，使用的限制性内切酶为BamHI和Not I。

进一步的：所述步骤(2)中所述分步酶切的方法为：首先将含有BamHI的PCR扩增体系在PCR仪中30℃反应10min，再向反应液中加入2ul的Not I，混匀离心后，在PCR仪中37℃反应10min。