[发明专利]一种基于血糖仪检测的检测载体有效
申请号: | 201910133154.0 | 申请日: | 2019-02-22 |
公开(公告)号: | CN109825519B | 公开(公告)日: | 2020-10-23 |
发明(设计)人: | 李冰凌;唐艺丹 | 申请(专利权)人: | 中国科学院长春应用化学研究所 |
主分类号: | C12N15/63 | 分类号: | C12N15/63;C12Q1/6897;C12Q1/70;C12Q1/689;C12R1/93 |
代理公司: | 长春众邦菁华知识产权代理有限公司 22214 | 代理人: | 周蕾 |
地址: | 130022 吉林*** | 国省代码: | 吉林;22 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 血糖仪 检测 载体 | ||
本发明涉及一种基于血糖仪检测的检测载体,该检测载体包括传感器序列和蔗糖酶序列;所述传感器序列为:TTTCGCTCTATTCTCATCAGTTTC ATGTCCTGTGTCGGACTTTAGAACAGAGGAGATAAAGATGGACACAGGACACAACCTGGCGGCAGCGCAAAAGATGCGTAAA;所述蔗糖酶序列是由耐高温蔗糖酶的氨基酸序列经密码子优化得到;所述传感器序列和蔗糖酶序列相连接,共同导入pET‑21a载体中。用本发明提供的基于血糖仪检测的检测载体检测基因与传统使用蔗糖酶作为标记检测目标基因相比,本发明不需要进行前期的纯化和标记过程,操作过程简单;此外蔗糖酶本身不存在检测体系中,与传统方法相比背景泄露相对较低。与原始立足点介导的基因表达检测方式相比,以蔗糖酶代替β半乳糖苷酶、荧光蛋白、乙醇乙酰转移酶、转肽酶等,利用商品化的血糖仪进行检测,更具便携性,同时能够检测更低的基因浓度。
技术领域
本发明涉及一种载体,具体涉及一种基于血糖仪检测的检测载体。
背景技术
随着核酸分子领域的发展,利用核酸快速准确地诊断多种疾病已成为可能。然而,这些检测方法通常需要复杂的仪器,不利于实现便携式的疾病诊断。市面上仅有的少数便携式诊断商品对于建立和开展新的便携诊断方法是非常具有参考价值的,例如葡萄糖检测仪(血糖仪)。目前,已有相关文献报道将血糖仪用于基因的检测(Angew.Chem.Int.Ed.2018,57,1-6;Anal Chem,2015,87,7676-7682;Anal.Chem.,2014,86,3869-3875;Nat Chem,2011,3,697-703)。这些方法首先需要将蔗糖酶进行大量表达,然后经过复杂的分离纯化过程后,将其与核酸分子相连接,带有蔗糖酶的核酸分子再与另一条带有磁球标记的核酸链杂交。当待测目标基因存在时,通过核酸链置换反应,将原本的带有蔗糖酶的杂交核酸链替换下来,游离到溶液中。利用磁铁将未与磁珠标记核酸链相杂交的蔗糖酶标记核酸链分离开来,最后加入底物蔗糖进行酶催化反应,利用血糖仪进行检测。这种方法的缺陷在于:1.蔗糖酶在反应过程中始终存在于检测溶液中,因此在不存在待测基因的情况下,未与磁球稳定结合的蔗糖酶易游离到溶液中,造成检测体系具有较高的背景泄露,即没有待测基因时,仍具有较高的血糖仪读数;2.蔗糖酶前期表达纯化以及与DNA连接和DNA与磁球连接过程复杂,不易操作;3.无法实现免标记和免分离的检测。
随着合成生物学的发展,学者们逐渐将合成生物学应用于基因的检测。合成生物学检测方法相对于现有的基因分析技术在于可以实现“现场表达”报告基因的免标记,免分离的基因检测。其检测体系主要由启动子和报告基因组成,当目标基因存在时,可引发报告基因的表达。美国哈佛大学Collins课题组曾设计出一种通过立足点介导引发的基因检测技术,其中报告基因为β半乳糖苷酶、荧光蛋白、乙醇乙酰转移酶、转肽酶等,可通过比色反应、荧光读数、气味对比或生成水凝胶等方法进行表征(Cell,2014,159,940-954;Cell,2014,159,925-939;Cell,2016,165,1-12;Sci Adv,2018,4,eaat 5105)。
基于合成生物学方法的免标记检测手段在没有待测基因的情况下,蔗糖酶不表达;只有加入待测基因后,才能够引发报告基因蔗糖酶的表达,因此可以解决上述检测方法中的高背景泄露问题;而且相比于提前表达和标记蔗糖酶的方法,将合成生物学方法配合无细胞表达系统,能够使检测操作更简便。目前已报道的利用合成生物学实现基因检测的方法中,立足点介导的基因表达最为简单,最有可能实现便携式基因诊断。但目前的检测方法在应用中存在两个弊端:(1)使用的报告基因为β半乳糖苷酶、荧光蛋白、乙醇乙酰转移酶、转肽酶等;通过待测基因引发报告基因表达,从而可以通过比色反应、荧光读数、气味对比或生成水凝胶等方法进行表征。上述表征方法在不加入恒温扩增反应时检测限仅能达到30nM。(2)在对新的待测基因进行检测时,由于新的待测基因序列不同,所结合的立足点不同,为了使检测传感器具有较高的信号比,往往需要重新设计整个传感器序列,设计过程十分复杂。
发明内容
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