[发明专利]检测SOD2基因rs4880位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒

说明书

本发明公开了一种SOD2基因rs4880位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用SOD2基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增SOD2基因片段，同时在SOD2基因特异性的引物界定的扩增区域内设计SOD2基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断SOD2基因rs4880位点多态性的方法不仅准确率高，而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床中大规模开展。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及SOD2基因rs4880位点多态性的分型检测方法与试剂盒。

背景技术

糖尿病是一种由于胰岛素分泌作用紊乱引起的具有复杂病因的代谢疾病，其特征是碳水化合物、脂肪和蛋白质出现代谢功能障碍。血脂异常与胰岛素抵抗一起发生，是导致心血管疾病重要的危险因素之一。脂蛋白性质的定量和定性变化，脂蛋白代谢降解，遗传易感性和环境因素是糖尿病性血脂异常的主要病因机制。最近的研究表明，编码参与脂蛋白代谢的酶和蛋白质的基因多态性可能在糖尿病性血脂异常的发展中起重要作用。因此，确定与糖尿病性血脂异常相关的遗传谱在降低微血管和大血管并发症的风险方面变得越来越重要。

锰依赖性超氧化物歧化酶（SOD2）是最重要的超氧化物歧化酶家族成员，存在于线粒体基质中，可以清除由线粒体中发生的多种氧化还原和电子传递反应产生的氧自由基。防止活性氧诱导的高血糖，氧化应激和电离辐射的损害。最近研究表明，SOD2中rs4880（C/T）位点的基因多态性与糖尿病性血脂异常有关。在糖尿病患者中，C等位基因携带者（CC/CT）血脂异常的风险较高。因此，rs4880（C/T）可作为早期检测标志物判断糖尿病性血脂异常的风险。

目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。

分子信标（Molecular Beacon）在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团（F），3′端标记淬灭基团（Q）。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近（约为7-10nm）。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被淬灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比（图1）。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变（包括单碱基的错配、缺失或插入突变）效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。