[发明专利]纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司他丁的药物组合物

说明书

本发明提供一种乌司他丁及其制备方法，5万单位/ml的乌司他丁在405nm处的吸光度值不超过0.09，人尿激肽原酶的含量不超过0.00025PNAU，重金属含量不超过0.8μg/ml，细菌内毒素含量不超过3.0EU/ml。通过亚硝酸盐、硫酸铵、聚乙二醇、调节pH等方法对尿液进行预处理，同时在过柱前采用透析的方法进行初步的纯化，再依次通过凝胶柱和阳离子交换柱制备得到乌司他丁纯品，大大简化了制备工艺的同时保证成品的纯度和收率，药物活性有很大提升。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及纯化的乌司他丁及其制备方法和含有该乌司他丁的药物组合物。

背景技术

乌司他丁是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化出来的一种糖蛋白，由143个氨基酸组成，相对分子质量约67000。1909年，Beurer和Reich第一次报道了人尿液中存在这种胰蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等丝氨酸蛋白酶及粒细胞弹性蛋白酶、透明质酸酶、巯基酶、纤溶酶等多种酶有抑制作用。另具有稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放，抑制心肌抑制因子(MDF)产生，清除氧自由基及抑制炎症介质释放的作用。乌司他丁还可改善手术刺激引起的免疫功能下降、蛋白代谢异常和肾功能降低，防止手术刺激引起的对内脏器官与细胞的损伤以及改善休克时的循环状态等。

乌司他丁多样的生物功能与其独特的分子结构相关，乌司他丁主要由3个功能域构成，包括O连接糖基化区域(Alal-Lys21)、N端Kunitz型结构域I(Lys22-Arg77)和具有胰蛋白酶抑制活性的C端Kunitz型结构域II(Thr78Leul43)。两个Kunitz型结构域具有一定的同源性，每个结构域中都含有6个保守的半胱氨酸，通过形成3对二硫键维持一定的空间构型。乌司他丁的酶抑制活性主要存在于主体蛋白骨架中的Kunitz型结构域。

专利CN100528898C公开了高纯度乌司他丁及其制备方法和含有乌司他丁的药物组合物，其中乌司他丁粗品经过阴离子交换柱、金属螯合柱、亲和层析柱等多重柱层析制备得到。专利CN100425286C公开了纯化的乌司他丁及其制备方法和含有乌司他丁的药物组合物，同样经过阴离子交换柱、金属螯合柱、疏水柱吸附、凝胶柱层析等多种柱层析制备得到。上述专利中纯化方法经过多次柱层析，工艺过程复杂，产品收率低，生产周期长，不易放大生产。CN 107827976 A公开了一种基于疏水柱的乌司他丁纯化方法，仅仅通过一步疏水柱实现纯化，并且纯度达到了99.90％以上，比活力至少为5100U/mg，但是其疏水柱采用尿素进行保藏而实现重复利用，再次使用大大影响了乌司他丁纯品的收率。

发明内容

基于上述现有技术的缺陷，本发明提供一种乌司他丁及其制备方法与应用，该乌司他丁中杂质含量少，通过改变粗品制备方法和改进纯化工艺，进一步控制乌司他丁分子量范围，显著提高了药物活性。

本发明提供一种乌司他丁，其浓度为5万单位/ml时，在405nm处的吸光度值不超过0.09，人尿激肽原酶的含量不超过0.00025PNAU，重金属含量不超过0.8μg/ml，细菌内毒素含量不超过3.0EU。

进一步地，所述乌司他丁浓度为5万单位/ml时，在405nm处的吸光度值不超过0.08，人尿激肽原酶的含量不超过0.0002PNAU，重金属含量不超过0.5μg/ml，细菌内毒素含量不超过2.5EU。

进一步地，所述乌司他丁采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的分子量为37,000-43,000Da或采用高效液相色谱法测定的分子量为62,000-72,000Da。

本发明进一步提供一种上述乌司他丁的制备方法，包括以下步骤：

(1)尿液中加入亚硝酸盐，调节pH，搅拌，硫酸铵溶液进行洗脱，洗脱液进行抽滤，保留滤饼；

(2)滤饼加水溶解，调节pH，加入聚乙二醇，过滤，沉淀物干燥；

(3)步骤(2)沉淀物加水溶解，透析，干燥，即得乌司他丁粗品；