[发明专利]检测CYP4F2基因rs2108622位点多态性的人工模拟核酸分子信标与试剂盒

说明书

本发明公开了一种CYP4F2基因rs2108622位点多态性的分型检测方法与试剂盒。本发明采用CYP4F2基因特异性的引物SEQ1和SEQ2扩增CYP4F2基因片段，同时在CYP4F2基因特异性的引物界定的扩增区域内设计CYP4F2基因特异性人工模拟核酸分子信标SEQ3‑FAM和SEQ4‑VIC。本发明提供的基于基因特异性PCR结合人工模拟核酸分子信标判断CYP4F2基因rs2108622位点多态性的方法不仅准确率高，而且还具有检测速度快、操作简单、结果判读客观、闭管反应污染少等优点，非常适合于在临床中大规模开展。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CYP4F2基因rs2108622位点多态性的分型检测方法与试剂盒。

背景技术

血栓一般通俗地称为血凝块，是止血凝血步骤的最终产物。血栓由不溶性纤维蛋白，沉积的血小板，积聚的白细胞和陷入的红细胞组成。当机体受到损伤时，血栓具有止血的功能；但是当血栓阻塞血液流过健康的血管，造成血管部分或完全堵塞时将会对机体造成损害。血栓栓塞性疾病是血栓由形成部位脱落，在随血流移动的过程中部分或全部堵塞某些血管，引起相应组织和(或)器官缺血、缺氧、坏死(动脉血栓)及淤血、水肿(静脉血栓)的病理过程。

华法林是香豆素类抗凝剂的一种，在体内有对抗维生素K的作用。可以抑制维生素K参与的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的在肝脏的合成，主要用于防治血栓栓塞性疾病。作为最常用的口服抗凝剂，其治疗窗口相当狭窄，其剂量必须根据国际标准化比率（INR）进行调整。用量过大会有较高的出血风险，用量过低则会发生栓塞。许多临床和环境因素，以及基因突变都会影响华法林的剂量要求。

细胞色素P450 4F2（CYP4F2）是细胞色素P450超家族成员，该基因是19号染色体上细胞色素P450基因簇的一部分。细胞色素P450是单加氧酶，其催化涉及药物代谢、胆固醇、类固醇和其它脂质合成的许多反应。该蛋白定位于内质网，启动强效炎症介质白三烯B4的灭活和降解过程。该基因座中rs2108622（C/T）位点多态性与华法林的剂量需求紧密相关，CT、TT基因型携带者比CC基因型需要更高的华法林剂量，例如在中国汉族人群中，CT型和TT型患者平均每日的华法林剂量比CC型分别高出7%和18%。因此，在开药之前应对该位点进行检测，以确定最佳的给药剂量。

目前，基因多态性检测的方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、高分辨率溶解曲线法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测基因多态性，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。高分辨率溶解曲线法对仪器要求高，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在困难。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号。此外，Taqman探针对于单碱基错配识别能力较差，极易生成 非特异荧光信号，干扰结果判读，进而影响检测的准确性。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测基因多态性的方法。