[发明专利]一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物、RPA探针、试剂盒及核酸检测方法

权利要求书

1.一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的通用的RPA引物和RPA探针，其特征在于，所述的RPA引物包括正向引物为PVRPAF，其序列为：CCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAAC，

反向引物为PVRPAB，其序列为：

Bio-CTCAAAAGAATAATATGGTGCACTATAACCAAC，

其中基于RPA引物扩增区域设计的RPA探针为PVRPAP，其序列为：

FAM-CTCCTTCAGCTTGAGGCAAAGAATTTAGAAATGGTGGHAAGCCCAATGCTC-C3spacer。

2.一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的RPA试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的RPA引物和RPA探针。

3.根据权利要求2所述的一种用于检测犬、猫、貂细小病毒的RPA试剂盒，其特征在于，还包括：(1)样品处理液：0.2M KOH溶液；(2)检测反应液：50mM pH7.9的Tris-HCl；100mM的乙酸钾；2mM的二硫苏糖醇；3mM的腺嘌呤核苷三磷酸；20mM的磷酸肌酸；5μg的肌酸激酶；5％质量分数的聚乙二醇，200μM的脱氧核糖核苷三磷酸，RPA引物，14mM的醋酸镁；(3)干粉管：3.75μg冻干的重组酶uvsX、750ng冻干的重组酶uvsY、30μg的单链结合蛋白、900ng链置换聚合酶；(4)侧流试纸条；(5)阳性对照反应液：含有犬、猫、貂细小病毒VP2基因片段；10mMpH8.0的TE缓冲液；(6)阴性对照反应液：10mM pH8.0的TE缓冲液；(7)上样处理液：0.01M pH为7.3的PBST缓冲液；(8)吸管；(9)无菌注射器，上述物质的浓度为在各试剂中的终浓度。

4.一种犬、猫、貂细小病毒的核酸检测方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(1)样品处理：用棉签采取待检动物粪便、呕吐物或分泌物，在1ml样品处理液中搅拌混匀，然后静置处理；

(2)扩增：在干粉管中滴加0.05ml检测反应液，然后加入用微量吸管吸取的上层样品处理液5ul，同时设立阳性及阴性对照，混匀，将干粉管置于操作者腰带下反应20分钟，得到反应液；

(3)判定：反应完成后用吸管吸取0.01ml的反应液加入到2ml上样处理液中混匀，然后将侧流试纸条放入上样处理液中进行结果测定，5分钟后观察判定结果：如阴性对照样品中的侧流试纸条只在C的位置上出现条带，阳性对照样品中的侧流试纸条在C和T的位置上都出现条带，表明试验成立，检测样品中的侧流试纸条的条带和阳性对照样品一样出现两个条带为阳性，表明待检动物中含有细小病毒；和阴性对照样品一样出现一个条带为阴性，表明待检动物中不含有细小病毒。