[发明专利]一种蛋白质氨基酸序列覆盖度的检测方法

说明书

本发明提供了一种蛋白质氨基酸序列覆盖度的检测方法。该蛋白质氨基酸序列覆盖度的检测方法包括蛋白还原烷基化、蛋白酶解、多肽脱盐、液质检测和数据分析，其中，蛋白酶解是通过加入弹性蛋白酶进行单酶切获得肽段，弹性蛋白酶与待检测的蛋白质的质量比为1：（20~100）。本发明的蛋白质氨基酸序列覆盖度的检测方法采用弹性蛋白酶实现单酶切，不需要模拟酶切预测来选择对应的酶；不需要多种酶切，只要一种酶；同时采用HLB柱脱盐，不会漏掉亲水性多肽，提高覆盖度；本发明的检测方法的快速简便、工作量少、检测周期短、价格经济，能够达到100%的氨基酸序列覆盖度。

技术领域

本发明属于蛋白质检测技术领域，涉及一种蛋白质氨基酸序列覆盖度的检测方法。

背景技术

目前，蛋白药物特别是抗体药物是近年来制药领域增长率最快的一类药物。氨基酸序列是蛋白药物的一级结构，是药物研究的基础。

蛋白质的测序方法主要有Edman降解法和质谱法。 Edman降解法最多可以测定N端的50~70个氨基酸，所以长度较短的多肽药物可以通过Edman降解法进行测序，但是对于蛋白质药物来说，氨基酸序列通常长达到100~1500个，Edman降解法一般只用来测定N末端15~30个氨基酸序列，而不适用于做蛋白全序列检测。如果需要进行蛋白序列检测，一般采用基于质谱的方法进行氨基酸序列覆盖度分析，作为蛋白质类药物的质量研究中理化性质的重要组成部分。

Edman降解法采用异硫氰酸苯酯（PITC）与待分析多肽和蛋白的N-端氨基在碱性条件下反应，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸处理，关环，N-端被选择性地切断，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来，酸作用下，形成一个稳定的苯基乙内酰硫脲（PTH）衍生物。通过用HPLC法分析生成的苯乙内酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鉴定出是哪一种氨基酸。去掉N-端氨基酸残基的多肽或蛋白，进入下一个循环，继续发生降解。

质谱法一般使用胰蛋白酶Trypsin对蛋白样品进行酶切，脱盐，获得的肽段进入质谱检测得到一级和二级谱图，将谱图与蛋白的理论多肽序列进行比对，得到样品的多肽序列，再将样品检测到的多肽序列与蛋白的理论序列进行比较，一般可以得到理论序列的60~90%的氨基酸序列覆盖度。

为了得到蛋白的全部序列信息，一般需要使用多种蛋白酶（Trypsin、Chymotrypsin、Asp-N、Glu-C、Lys-C等）分别对蛋白进行酶切，使酶切后的多肽长度介于5~50个氨基酸，即具有序列特异性同时产生较好的二级质谱图，最后通过对不同酶切产生的肽段的拼接和分析，实现蛋白质序列的100%的覆盖度。

但是除了Trypsin，其他几种酶如Chymotrypsin、Asp-N、Glu-C、Lys-C都比较昂贵。针对不同的酶需要不同的反应体系，操作繁琐。反应的时间也不一样，2~16个小时不等。有时即便用了多种酶也不一定能达到100%的序列覆盖度。

发明内容

基于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种蛋白质氨基酸序列覆盖度的检测方法。该方法采用弹性蛋白酶实现单酶切，不需要模拟酶切预测来选择对应的酶；不需要多种酶切，只要一种酶；同时采用HLB柱脱盐，不会漏掉亲水性多肽，提高覆盖度。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

本发明提供一种蛋白质氨基酸序列覆盖度的检测方法，该检测方法包括蛋白还原烷基化、蛋白酶解、多肽脱盐、液质检测和数据分析，其中，所述蛋白酶解是通过加入弹性蛋白酶进行单酶切获得肽段，弹性蛋白酶与待检测的蛋白质的质量比为1：（20~100）。

本发明的弹性蛋白酶为市售获得，购买厂商为Promega，型号为V1891。该弹性蛋白酶能够优先在丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的C末端进行剪切。

上述的检测方法中，优选地，所述多肽脱盐是对蛋白酶解后的肽段进行脱盐处理，具体为：