[发明专利]一种抗羊F17大肠杆菌感染的基因筛选方法

说明书

本发明公开了一种抗羊F17大肠杆菌感染的基因筛选方法，包括以下步骤：F17大肠杆菌感染发病羔羊和抗病羔羊的筛选及脾脏和肠道内容物样品的采集；F17大肠杆菌感染发病羔羊和抗病羔羊脾脏样品的高通量测序；F17大肠杆菌感染发病羔羊和抗病羔羊脾脏转录组学对比分析；以及抗F17大肠杆菌感染的基因（circRNA）的筛选及鉴定。本发明提出的抗羊F17大肠杆菌感染的基因的筛选方法，有针对性地从抗病羔羊脾脏中筛选具有抗F17大肠杆菌感染的基因（circRNA），准确性高、针对性强、节省时间。

技术领域

本发明涉及畜牧兽医技术领域，尤其涉及一种抗羊F17大肠杆菌感染的基因 筛选方法。

背景技术

在现代化的集约化养羊生产过程中，羔羊的饲养已成为最重要的环节之一。 羊大肠杆菌病是规模化羊场最为常见高发的细菌性疾病之一，传统沿用的抗生素 治疗方案存在诸多缺陷，此外，药物残留还严重影响畜产品的品质。因此需要寻 找和探究优质、安全的抗生素替代方法。羊大肠杆菌病，是由大肠杆菌引起的一 种以剧烈腹泻和败血症为特征的急性传染病，特别是产肠毒素大肠杆菌(ETEC) 感染引起的初生羔羊腹泻，又叫羔羊白痢。该病主要通过消化道感染，临床主要 表现为腹泻、虚脱，卧地不起，如不及时治疗，常在24～36h死亡。致死率15％～ 75％，给养殖户带来严重的经济损失。建立一种抗羊F17大肠杆菌感染的基因筛 选方法，有利于筛选出高效的基因，对防治羊F17大肠杆菌感染具有重要意义。

传统的基因筛选技术主要包括差减杂交技术、基因芯片技术。尽管目前我国 已开展了大量的疾病抗性基因的筛选工作，并且广泛应用于生产实践，但是这些 技术存在着盲目性、效率低以及针对性不强等缺点。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种抗羊F17大肠杆菌感染的基因的筛选方法，旨 在解决传统的基因筛选技术存在的盲目性、效率低以及针对性不强等缺点。

为实现上述目的，本发明提出了一种抗羊F17大肠杆菌感染的基因的筛选方 法，包括以下步骤：

步骤S1、挑选F17大肠杆菌感染的发病羔羊和抗病羔羊，对应采集发病羔 羊和抗病羔羊的脾脏和肠道内容物的样品；统计羔羊腹泻率，观察肠道组织形态 结构，计算肠道细菌数量；

步骤S2、提取发病羔羊和抗病羔羊的脾脏样品中基因组，进行高通量测序；

步骤S3、对高通量测序的测序数据进行转录组学对比分析；

步骤S4、根据转录组学对比分析的结果，比较发病羔羊和抗病羔羊脾脏中 的差异基因，根据分析结果和基因的功能确定筛选基因，即筛选出抗羊F17大肠 杆菌感染的基因。

所述的步骤S1包括：

将试验动物分为攻毒试验组和健康对照组，两组之间严格隔离饲养，组内羔 羊分栏单独饲养；攻毒试验开始前先饲喂不含抗生素的代乳料，并观察出生羔羊 的生理状态，若连续2天无羔羊出现腹泻现象，可排除由代乳料导致羔羊消化不 良而引起的腹泻，此时可进行攻毒试验；攻毒试验中，通过向羔羊灌喂F17大肠 杆菌菌液进行攻毒试验，每只羔羊每天接受F17大肠杆菌菌株的平均剂量是 4.6×10⁸CFU·mL^-1，每6小时观察一次羔羊状态，连续灌喂3d或直至羔羊出现 腹泻症状，攻毒试验中，每天观察羔羊粪便，以四种粪便黏稠度为标准进行记录， 挑选具有典型临床症状及明显病理损伤的发病羔羊和无典型临床症状及明显病 理损伤的抗病羔羊；

对应采集发病羔羊和抗病羔羊的肠道内容物的样品，于-80℃保存备用；

其中，临床症状包括羔羊痢疾、水样腹泻、精神不振，病理损伤包括羔羊肠 内充满黄色液体，肠系膜充血、小肠绒毛缩短；

在采集发病羔羊和抗病羔羊的脾脏和肠道内容物的样品过程中，至少要采集 3个重复作为样品。