[发明专利]一种结核分枝杆菌耐药性检测方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，其特征在于,该方法包括如下步骤：

S1：通过液氮低温研磨方法实现将结核分枝杆菌的菌壁破碎，释放结核分枝杆菌基因组；

S2:根据S1中裂解后的结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺酶基因的上下游序列设计PCR引物序列，引物序列不与吡嗪酰胺酶基因序列重叠，完整反应全长pncA基因，且PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子；

所述的启动子的引物序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'；

所述的表达增强子的引物序列为：5'-ATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGC-3'；

S3:通过高速离心方法对S2中的结核杆菌基因组进行浓缩，在浓缩的过程中进行抽真空；同时通过紫外吸收法对该结核杆菌基因组进行定量处理，通过紫外线灯实现精确控制光线的强度，进而实现高精度控制用于表达吡嗪酰胺酶的基因模板量；

S4:取S3中的结核杆菌基因组5-15微克植入小麦胚芽无细胞体中进行表达，表达时间为1-24小时；

S5:通过分光光度计测定S4中表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性。

2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，其特征在于：所述的小麦胚芽无细胞表达系统的启动子为T7启动子，增强表达子为5’端非编码区增强子和/或3’端非编码区增强子。

3.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，其特征在于：所述的结核杆菌基因组上扩增全长pncA基因适合小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子的引物对序列：

上游引物系列5'-TAATACGACTCACTATAGGCCCGCCCGAACG-3'，

下游引物序列：5'-GCCGCCAACAGTTC-3'。

4.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌耐药性检测方法，其特征在于：所述的结核杆菌基因组上扩增全长pncA基因适合小麦胚芽无细胞表达系统增强表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子和5’端非编码区增强子的引物对序列：列举三套含不同5’端非编码区增强子的上游引物序列

5'-TAATACGACTCACTATAGGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACACCCGAACGTAAGGAGGACGT-3'；或

5'-TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3'；或

5'-TAATACGACTCACTATAGGGATTGTGAGCGATTTGCGTGCGTGCATCCCGCTTCACTGATCTCTTGTTAGATCTTTTTATAATCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3'；

下游引物序列：5'-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3'。