[发明专利]一种分子层析PCR检测方法

权利要求书

1.一种分子层析PCR检测方法，其特征在于：采用一种多层垂直流动型层析检测卡盒，该检测卡盒具有一体化的壳体构件，包括位于卡盒上部的第一壳体构件(1)以及位于卡盒下部的第二壳体构件(2)，所述第一壳体构件(1)上设有加样窗(10)，加样窗(10)下设置检测试纸，该检测试纸由上至下包括：由过滤衬垫(3)和第一过滤膜(4)组成的缀合物垫(15)、由加固垫(5)和第二过滤膜层(11)组成的结合物垫(16)、一至若干层吸水垫；该检测试纸将加样区与检测区结合在一起，形成一种垂直流动型层析结构；该卡盒的第二壳体构件(2)内具有一个受力支撑构件(8)和一个与缀合物垫(15)连接在一起的收缩构件(9)，受力支撑构件(8)挤压缀合物垫(15)、结合物垫(16)和吸水垫，使之与加样窗(10)紧密贴合在一起；触动收缩构件(9)，移开与收缩构件(9)连接在一起的缀合物垫(15)，使缀合物垫(15)与结合物垫(16)相互分离，使位于结合物垫(16)上的检测区暴露于加样窗(10)，从而使结果可视化；

所述检测方法包括如下步骤：

第一步，将待测样品进行PCR反应，得到PCR产物；

第二步，将待测样品标记的PCR产物放置于所述检测卡盒的缀合物垫(15)上，待测样品标记的PCR产物会将缀合物垫(15)上的交联体溶解，通过第一过滤膜(4)的渗透过滤作用，将液体渗透到包被了抗体的结合物垫(16)上，包被在结合物垫(16)上检测线或点(52)的抗体与样本中的待检片段及胶体金形成一个双抗体夹心的免疫复合物，出现紫红色沉淀带；过量的样品胶体金复合物会继续渗透到包被在结合物垫(16)上的质控线或点(51)，与质控线或点(51)上的Biotin-牛血清白蛋白结合，也出现紫红色沉淀带，质控线或点(51)若没有出现紫红色沉淀带，表示该检测是无效的；

第三步，激活检测卡盒开关，查看结果。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：第一步中，所述待测样品在进行PCR反应之前，增加如下步骤：

(1)待测样品在增菌培养基中36℃增菌培养18-24小时；

(2)取上述增菌后液体，加入到含缓冲剂的EP管内，100℃煮沸10min；

(3)EP管冷却至室温，取部分管内液体，加入到含反应试剂的PCR管中。

3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：第一步中，将PCR管放入热循环仪中，反应90min；取出PCR管，滴加4滴缓冲液。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：第二步中，将PCR管内所有液体加至所述检测卡盒中反应2min后，再滴加4滴缓冲液，反应1min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述吸水垫和加固垫(5)通过第二过滤膜(11)相互连接，所述过滤衬垫(3)和加固垫(5)通过第一过滤膜(4)相连接；所述结合物垫(16)的第二过滤膜(11)上设有与加样窗(10)边缘垂直相对的凹陷的环形导流槽(14)，用于让样液集中在检测区域。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测试纸的检测区与所述加样窗(10)位置垂直对应，样液流动方向为从加样窗(10)向位于试纸底层的吸水垫方向垂直流动；所述加样窗(10)与所述缀合物垫(15)接触，所述加样窗(10)包括套环或O型环状窗框，使缀合物垫(15)不与第一壳体构件(1)直接接触，而是通过加样窗(10)在受力支撑构件(8)的挤压下压紧缀合物垫(15)，使加样窗(10)周围不留缝隙；将样液滴加到加样窗(10)，则待测样液接触并垂直穿透缀合物垫(15)到达结合物垫(16)底层的第二过滤膜(11)；多余的液体直接渗透到吸水垫或沿环形导流槽(14)汇入吸水垫。