[发明专利]改进的基因组编辑方法

说明书

本发明涉及基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种改进的基因组编辑系统和方法，其具有高特异性，并且能获得稳定的突变类型。

技术领域

本发明涉及基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种改进的基因组编辑系统和方法，其具有高特异性，并且能获得稳定的突变类型。

背景技术

基因组编辑技术是基于特异性核酸酶对基因组进行靶向修饰的基因工程技术，在农业和医学研究中发挥着越来越强大的作用。成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated)是目前使用最广泛的基因组编辑工具，因其高效率、使用简单，在全球范围内引起了基因编辑领域的革命。

CRISPR/Cas9系统虽然有较高的基因定点修饰效率，但是由于同源重组效率较低，基因组单碱基的突变效率仍然较低。哈佛大学David Liu团队的Komor等将CRISPR/Cas9和胞嘧啶脱氨酶结合，创造了单碱基编辑系统，该系统可以实现定点C至T的高效替换^[1]。此后，各种基于脱氨酶的单碱基编辑系统也层出不穷，常兴等人建立的TAM(targeted AID-mediated mutagenesis)利用人源胞嘧啶脱氨酶融合dCas9(dCas9-AIDx)，也可以达到单碱基编辑的目的^[2]。Keiji Nishida等将来源于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶与Cas9蛋白和UGI融合，在哺乳动物细胞中实现了约15％～55％的靶向突变^[3]。斯坦福大学的科学家将胞嘧啶脱氨酶融合到MS2蛋白上，创造了CRISPR-X系统，也可以得到较高的单碱基突变效率^[4]。

基于CRISPR的单碱基编辑系统，其可以在特定的靶序列处导致少至一个碱基的替换，但是靶序列长度并不发生改变，即，靶序列突变后与突变前长度相同，仅存在一个或多个碱基的差异。由于CRISPR系统自身存在脱靶的可能，CRISPR核酸酶可以结合与gRNA存在一定差异的靶位点，并产生编辑。所以，在原有的gRNA协助下，单碱基编辑系统仍有可能识别发生碱基替换之后的靶位点，并进一步实施碱基替换。这带来的潜在风险是突变类型不能稳定存在。这样的风险在其它基因组编辑系统中同样存在。

因此，本领域仍需要新的基因组编辑系统和方法，其具有高特异性，并且能获得稳定的突变类型。

发明简述

在一方面，本发明提供一种用于对细胞基因组中的至少一个基因组靶序列进行定点修饰的基因组编辑系统，其包含：

1)包含gRNA的编码序列的表达构建体，所述gRNA靶向所述至少一个基因组靶序列；

2)包含CRISPR核酸酶编码序列的表达构建体；和

3)包含gRNA编码序列的表达构建体，所述gRNA靶向所述CRISPR核酸酶编码序列中的靶序列，

其中在导入细胞后，靶向所述至少一个基因组靶序列的gRNA指导所述CRISPR核酸酶靶向所述至少一个靶序列并导致所述靶序列中的一个或多个突变，靶向所述CRISPR核酸酶编码序列中的靶序列的gRNA指导所述CRISPR核酸酶靶向所述CRISPR核酸酶编码序列中的靶序列并导致所述CRISPR核酸酶的失活突变。

在另一方面，本发明提供了一种修饰细胞基因组中至少一个基因组靶序列的方法，包括将本发明的基因组编辑系统导入所述细胞。

在另一方面，本发明还提一种产生经遗传修饰的细胞的方法，包括将本发明的基因组编辑系统导入细胞中。

在另一方面，本发明还提供经遗传修饰的生物体，其包含通过本发明的方法产生的经遗传修饰的细胞或其后代。

在仍另一方面，本发明还包括用于本发明的方法的试剂盒，该试剂盒包括本发明的基因组编辑系统，以及使用说明。