[发明专利]一种编码牙鲆胞外ATP水解酶CD39的cDNA全长序列及其应用

说明书

本发明公开了牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因的检测方法及其对鱼类天然免疫的调节作用。本发明通过以不同物种CD39基因编码区序列的保守区设计简并引物，经反转录及PCR扩增，结合RACE技术最终得到牙鲆CD39的全长cDNA序列。牙鲆CD39蛋白是一种重要的胞外ATP水解酶，其通过控制细胞外ATP浓度，对鱼类胞外ATP介导的天然免疫应答起重要调节作用。本研究为鱼类天然免疫调控的分子机制研究提供了新的证据，亦可为针对鱼类CD39蛋白的免疫功能调节剂研发奠定重要基础。

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体是牙鲆胞外ATP水解酶CD39基因全长cDNA序列及其编码的蛋白，以及该基因的克隆和应用。

背景技术

近年来，随着人民生活水平的日益提高，鱼类作为一种高蛋白低脂肪的食物受到人们越来越多的亲睐。由于水产养殖规模在世界范围内不断扩大，国内外水产品贸易及水产苗种跨区域交流的日益频繁，水产养殖动物病原传播的机会大大增加。此外，由于现代水产养殖业的高度集约化和高密度生产特点，导致渔业水域环境恶化和水体细菌大量繁殖，引发养殖动物应激反应，导致机体免疫系统受到抑制。上述内外因素的相互作用，导致世界范围内水产养殖动物疾病爆发趋于频繁，流行范围趋于广泛，从而给养殖业带来了极大的经济损失。通过运用现代生物学技术作为水产养殖的技术支撑，对经济动物病害进行免疫防治是水产动物疾病防治的重要手段。因此，近年来鱼类免疫学研究在国际上受到了越来越多的重视。

鱼类和哺乳动物的免疫系统具有一定的保守性。为了适应水体环境，鱼类演化出自身特有的免疫特性，具有天然免疫和获得性免疫应答两个系统，但其获得性免疫系统并不完善，因此，天然（先天）免疫在鱼类免疫系统中扮演着更重要的作用。

研究表明，机械损伤、免疫刺激、细胞坏死、细胞凋亡及病原侵染等条件下，细胞可通过胞吐、离子通道的方式将ATP从细胞内迅速释放到细胞外。胞外ATP是一种可以激活宿主天然免疫应答的强效促炎症信号分子，其通过作用于细胞膜表面P2嘌呤受体或ATP激活的离子通道，触发不同的下游信号（如Ca²⁺信号、环腺苷酸信号和蛋白激酶信号等），形成嘌呤免疫信号通路，广泛参与了机体的天然免疫应答调控。然而，过高的胞外ATP浓度可以诱导细胞产生过度的天然免疫反应，对机体产生不利影响。因此，胞外ATP的浓度必须受到严格控制。通过胞外核苷酸酶水解胞外ATP，从而降低胞外ATP的可利用浓度，将胞外ATP的促炎症效应维持在适度水平，是维持机体免疫稳态的重要途径。

胞外二三磷酸核苷酸水解酶I（ecto-nucleoside triphosphatediphosphohydrolase，e-NTPDase），亦称为CD39，是一种广泛分布于植物、动物等真核生物中，分子量约为70~100kD、定位于细胞膜上的糖蛋白。CD39是嘌呤免疫信号通路的重要组成成员，其主要作用是水解ATP和ADP，形成AMP，后者再由5'胞外核苷酸酶（CD73）水解为腺苷，进而将胞外ATP的促炎症效应转化为抗炎症效应，以维持机体适度、有效的免疫应答。 CD39对机体天然免疫应答起重要调节作用。研究表明，CD39可以调节胞外ATP受体P2X7介导的细胞凋亡及促炎性细胞因子IL-1β和IL-8的释放；CD39还可以将TLR受体诱导释放的胞外ATP迅速水解为腺苷，进而减弱巨噬细胞的活化程度；此外，过表达CD39有助于呼吸道上皮细胞抵抗绿脓假单胞菌侵染。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）属碟形目、牙鲆科、牙鲆属，俗称“比目鱼”、“左口”，是我国以及东亚地区主要的海水养殖鱼类，具有较高的经济价值。随着近年来养殖规模的不断扩大，病毒、细菌等病原体导致的流行性病害在集约化养殖条件下爆发日趋频繁，对牙鲆养殖业造成了严重的经济损失，严重制约了牙鲆养殖业的健康可持续发展。目前，由于对于牙鲆免疫调控分子机理了解较少，致使相关免疫防治技术的开发与应用受到严重的制约。