[发明专利]一种检测侵染当归JHMV病毒的IC-RT-LAMP试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP检测引物组合物，其特征在于：由RT反向引物JHMV-R和LAMP引物组组成，所述LAMP引物组由正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：

JHMV-R：5’-TTGTCGGAATGTGGGTGA-3’；

F3：5’- GATTATGAATATGAGCCACCTC -3’；

B3：5’- CCGTTTATATTTGGGGAGGT -3’；

FIP：5’- ACCATCGAGCAAACTGATTCTGATAACCCAGAGCAGACAGAT -3’；

BIP：5’- TCGACGGCATCAAAGGAGATTATTTCAATGCACCACACGAC -3’；

LF：5’- TGTTGCTCTTGTGTTGGCTAG -3’；

LB：5’- GGTCTGAATGATGCGGAAATGG -3’。

2.权利要求1所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物在检测日本金鱼藻花叶病毒中的应用。

3.一种采用如权利要求1所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒的IC-RT-LAMP试剂盒，所述试剂盒由JHMV抗体IgG、权利要求1所述的IC-RT-LAMP检测引物组合物、第一链cDNA合成试剂和LAMP扩增反应试剂组成；

其特征在于：所述试剂盒还包括JHMV抗体IgG包被缓冲液（CB）、磷酸缓冲液（PBS）、磷酸洗涤缓冲液（PBST）、SYBR Green I荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；所述阴性对照品为ddH₂O；所述阳性对照品为当归 JHMV CP基因标准品；所述阳性对照品序列如下：

当归JHMV CP基因标准品：

CGCCAAAGAAGGATAAAGGGAAGGGACCTGAATCCTCGAACACACAAGATGACAATCAGTTGGCGCAAGCAAGCAAAGACAGAGATATTGATATGGGCACTAGTGGCACATTTGCTGTACCTAGATACAAGATTTTTAAATCCAAATTGAGGTTCCCAATGGTTAGGGGCAGGAAGATTATGAATATGAGCCACCTCGCACAATATAACCCAGAGCAGACAGATCTAGCCAACACAAGAGCAACACAGAATCAGTTTGCTCGATGGTTCGACGGCATCAAAGGAGATTATGGTCTGAATGATGCGGAAATGGACGTCATGTTGAATGGGCTTGTCGTGTGGTGCATTGAAAATGGAACCTCCCCAAATATAAACGGATTGTGGACTATGATGGATGGAGAGGAACAAGTTGAGTATCCAATTAAACCATTAATAGATCATGCGTCACCCACATTCCGACAA。

4.权利要求3所述的特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒IC-RT-LAMP试剂盒在检测日本金鱼藻花叶病毒中的应用。

5.一种采用如权利要求3所述的IC-RT-LAMP试剂盒特异性检测侵染当归的日本金鱼藻花叶病毒的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

①抗体制备：纯化JHMV病毒粒子，用其免疫动物，获得特异性的JHMV抗体IgG；

②免疫捕获IC：将步骤①获得的特异性的JHMV抗体IgG包被在反应容器中，捕获待测样品中的JHMV粒子；

③反转录RT：以步骤②捕获的JHMV粒子为模板，利用JHMV的RT反向引物JHMV-R和第一链cDNA合成试剂进行反转录RT反应获得第一链cDNA；

④LAMP扩增：以步骤③得到的第一链cDNA作为模板，用LAMP特异性引物组和LAMP扩增反应试剂进行LAMP扩增；并以ddH₂O作为阴性对照，以当归JHMV CP基因标准品作为阳性对照；

⑤分析判断反应产物：以步骤④中所得LAMP扩增反应产物判断待测样品是否含有日本金鱼藻花叶病毒。