[发明专利]生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法

说明书

本发明公开了一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)对生物样品进行处理；和(2)采用超高效液相色谱‑质谱联用仪检测所述待测溶液。本发明的检测方法能够检测到生物样品中较多的虎杖苷代谢产物，从而为阐明虎杖苷的代谢途径奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法。

背景技术

虎杖为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎和根。从虎杖中分离出来的虎杖苷被认为是虎杖主要的一种天然活性成分，具有较强的生物活性。现代药理学研究表明，虎杖苷对心肌细胞、血管平滑肌细胞、抗血小板聚集、改善微循环等有显著作用,此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用，常被作为虎杖药材或虎杖苷复方制剂的质控指标。然而，目前，虎杖苷的体内代谢过程和代谢产物尚不明确。继续进一步研究。

文献《LC-MS/MS测定大鼠血浆中虎杖苷浓度》(药学实践杂志，2012，30(1)，45-48)公开了测定大鼠血浆中虎杖苷浓度的LC-MS/MS方法，该方法采用二苯乙烯苷为内标，血浆样品用乙腈沉淀蛋白，流动相为甲醇-乙腈-0.1％甲酸水溶液，流速0.3ml/min，柱温30℃。该方法重点将血浆中的虎杖苷进行较好的分离，但没有考虑虎杖苷代谢产物的分离。

文献《液相色谱-串联质谱法同时测定血浆中白藜芦醇苷及其代谢产物》(分析化学，2007年9月，35(9)，1309-1313)公开了采用液质联用检测并分离血浆中白藜芦醇苷及其代谢产物白藜芦醇的方法。流动相为乙腈和水，梯度洗脱方法为：0～2min，30vol％～60vol％乙腈；2～6min，60vol％～100vol％乙腈；6～14min，100vol％～30vol％乙腈，流速0.2ml/min，柱温30℃。该方法仅针对血浆中白藜芦醇苷及白藜芦醇进行分离分析，而不涉及白藜芦醇苷在体内大量代谢产物的分离。

文献《大鼠肠道菌对虎杖苷的生物转化研究》(中国药学杂志，2012年4月，47(8)，631-634)中通过离体和整体实验观察了大鼠肠内菌对虎杖苷的代谢以及虎杖苷在大鼠胃肠道内的生物转化进行初步研究，并采用HPLC和LC-MS/MS技术对胃、肠容物及粪便中所含的虎杖苷以及白藜芦醇的含量进行测定。该方法的LC-MS方法采用流动相为0.02％氨溶液-乙腈，梯度洗脱。本方法同样仅研究虎杖苷及其代谢物白藜芦醇两种成分，代谢成分简单，不涉及白藜芦醇苷在体内大量代谢产物的分离。

因此，需要一种全面检测虎杖苷代谢产物的检测方法。

发明内容

本发明的目的是建立一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，该方法能够较全面地检测虎杖苷的代谢产物。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种生物样品中虎杖苷及其代谢产物的检测方法，包括如下步骤：

(1)对生物样品进行处理：将C₁₈固相萃取柱用1～3倍柱体积的甲醇进行活化，再用1～3倍柱体积的去离子水进行平衡，然后取0.2～2倍柱体积的生物样品加入所述固相萃取柱，依次以1～3倍柱体积的去离子水和0.5～2倍柱体积的甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，吹干，残渣用0.02～0.2倍柱体积的体积浓度为2vol％～7vol％的乙腈水溶液复溶，涡旋振荡，离心，取上清液作为待测溶液；其中，所述生物样品包括生物体吸收虎杖苷后的含有虎杖苷及其代谢产物的含药血浆样品和/或含药尿液样品；

(2)采用超高效液相色谱-质谱联用仪检测所述待测溶液，其中：

色谱条件为：色谱柱：C₁₈色谱柱；流动相：0.1vol％甲酸水溶液A与乙腈B；柱温：40℃；梯度洗脱程序：0～2min，5vol％～20vol％B；2～15min，20vol％～54vol％B；流速：0.35mL/min；进样量：2μL；