[发明专利]一种构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法

说明书

本发明提供一种构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法，包括以下步骤：(1)构建用于表达SEQ ID NO：6所示的CREnhancer 2.0基因的质粒；(2)构建用于表达sgRNA的质粒；(3)将步骤(1)的质粒提前导入到间充质干细胞中，筛选得到阳性细胞后，再转入步骤(2)的质粒。本发明筛选并优化获得了最佳的sgRNA，使用了新的增效蛋白CREnhancer 2.0，在间充质干细胞中，构建了RBM17基因敲除的细胞系，基因编辑效率高，传代稳定。

技术领域

本发明提供一种采用CRISPR-CAS系统针对间充质干细胞进行RBM17基因编辑的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)，是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。由于间充质干细胞具备的这种免疫学特性，使其在自身免疫性疾病以及各种替代治疗等方面具有广阔的临床应用前景。

RNA结合基序蛋白17(RBM17)编码一种RNA结合蛋白，该蛋白参与RNA剪接体复合物的构成，并且在mRNA剪接的第二催化步骤中发挥作用。RBM17包含一个非结构化N-末端结构域，一个G-补丁基序，以及一个mRNA剪接必需的C端的RNA识别基序。在人类中，RBM17在正常乳腺、肝、前列腺和胰腺的导管上皮中均有低表达，但是其在很多人类癌症中均有过表达；现有技术中已经发现，通过抑制靶细胞中RBM17基因的表达，可进一步抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，可见，RBM17基因敲除在肿瘤治疗中具有重要意义。

基于间充质干细胞的多能性，为了研究敲除RBM17基因的间充质干细胞在癌症治疗方面的功能，建立敲除RBM17基因的间充质干细胞细胞系变得尤为重要。现有技术中，仍然存在基因编辑效率不够高，不能稳定遗传等问题。

发明内容

鉴以此，本发明提供一种构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法，构建出一种敲除RBM17基因的间充质干细胞，克服了现有技术中基因编辑效率不够高的技术缺陷。

本发明的技术方案是：

一种构建RBM17基因敲除的间充质干细胞细胞系的方法，包括以下步骤：

(1)构建用于表达SEQ ID NO：6所示的CREnhancer 2.0基因的质粒；

(2)构建用于表达sgRNA的质粒；

(3)将步骤(1)的质粒提前导入到间充质干细胞中，筛选得到阳性细胞后，再转入步骤(2)的质粒。

优选的，所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞(hMSCs)PC015。

所述的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明筛选并优化获得了最佳的sgRNA，使用了新的增效蛋白CREnhancer 2.0，在间充质干细胞中，构建了RBM17基因敲除的细胞系，基因编辑效率高，传代稳定。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

实施例1、CRISPR表达载体的构建

1.1sgRNA的设计

设计具体的sgRNA如下(SEQ ID NO:1～5)：

RBM17-sgRNA1:5'-ctcctcctcatgtctgcctc-3'