[发明专利]一种单个花环样神经干细胞定向培育方法

说明书

一种单个花环样神经干细胞定向培育方法，利用人多功能干细胞消化培养获得特定小直径拟胚体，通过加入ROCK inhibitor Y‑27632与添加剂B27促进成球，经分化培养即可获得占比不少于80%的单个花环样神经干细胞。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体地说涉及一种单个花环样神经干细胞定向培育方法。

背景技术

人多能干细胞是近些年来发展最迅速的领域之一，并受到广泛的关注。在神经科学领域，已有研究机构应用人多能干细胞成功构建分别具有大脑皮层、视网膜和小脑等特定部位特性的细胞组织团块，为人类神经发育的研究带来了焕然一新的前景。

早期神经发生过程——神经胚形成，被认为是人类胚胎发育中的关键阶段，神经胚在各种因素的精密调控下发育为大脑、脊髓和其他神经系统。既往关于脑发育体外模型方法学的研究总结发现，神经胚形成被描述为细胞组织团块内花环样神经干细胞结构的产生，即一个花环样神经干细胞结构象征一个神经胚。然而在同一个组织团块内存在多个花环样神经干细胞结构，且具有多样的细胞组织形态，处于非均一的发育阶段，给神经发育研究带来了许多争议与不便。最重要的是，人类整个神经系统起源于单个神经胚，故仍然不确定这些模型是否能够模拟早期神经发生过程。因此，应用人多能干细胞建立单个花环样神经干细胞的分化体系，能够在体外模拟单个神经胚形成，为胚胎时期神经发育研究提供了稳定的实验基础与可靠保障。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种人多功能干细胞体外定向培养获得高收率单个花环样神经干细胞的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种单个花环样神经干细胞定向分化方法，包括如下步骤：

（1）在基质胶系统下，在适宜环境下选用干细胞培养液贴壁培养人多能干细胞，直至60%-80%的密度；

（2）将步骤1得到的人多能干细胞用EDTA消化，离心后，转移至培养瓶，利用移液管反复吹打以获得直径小于200µm的拟胚体，然后用神经诱导分化液悬浮培养，同时添加ROCKinhibitor Y-27632与添加剂B27促进成球，该日记为第0天；

（3）第2天，在孔板中铺设封孔膜，倒置显微镜下选取直径80-120µm的拟胚体与液态基质胶混合滴于封孔膜上，与37℃加热至液态基质胶凝固后，加入神经诱导分化液，继续于37℃培养，第4天获得单个花环样神经干细胞。

其中，所述步骤（2）中选用EDTA消化可以将干细胞克隆消化为若干片块，更利于获取直径小于200µm的拟胚体，是获得单个花环样神经干细胞的重要基础。利用移液管反复吹打，防止人多能干细胞经消化后易损伤，并利于更好获得直径小于200µm的拟胚体。

进一步地，所述ROCK inhibitor Y-27632添加量为10µM，添加剂B27添加量按体积百分比为培养体系的2%。此处ROCK inhibitor Y-27632的加入显著改善了细胞的成活率，加入B27促进细胞成球。

优选地，所述步骤（1）中的干细胞培养液包括500ml Essential 8基础培养基和50ml Essential 8添加剂。

优选地，所述步骤（2）与步骤（3）中的神经诱导分化液包括500ml DMEM/F12培养基、5ml N2添加剂、5ml非必需氨基酸。

进一步地，为了避免死细胞过多与促进细胞增殖分化，从开始计时起，每24小时更换一次神经诱导分化液。