[发明专利]一种可增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体pcDNA3.1-FYJNa的应用

说明书

FYJNa过表达载体pcDNA3.1‑FYJNa在显著增强A549/DDP细胞ABCC1基因表达中的应用，属于基因工程技术领域，其特征在于，FYJNa过表达载体pcDNA3.1‑FYJNa在显著增强A549/DDP细胞ABCC1基因表达中的应用的FYJNa基因核苷酸序列如Seq ID No:1所示。利用对A549/DDP细胞进行总RNA提取后反转录为cDNA，找到CREB1基因的CDS区及对应的mRNA序列，设计引物，加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点，扩增CREB1基因CDS区；然后进行中性突变，酶切载体，连接目的片段与载体，重组表达载体，亚克隆完成后进行点突变，分别检测FYJNa和ABCC1基因mRNA和蛋白的表达水平，结果显示过表达FYJNa可上调ABCC1的mRNA和蛋白水平的表达。

技术领域

本发明涉及一种可增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体pcDNA3.1-FYJNa的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

ABCC1基因是ATP结合盒(ABC)药物转运蛋白超家族中C亚族成员之一，于1992年首次从耐药肺癌细胞系H69AR中鉴定出来(Cole et al.,1992)；该基因定位于染色体16p13.11，它的长度约为200,000碱基对，该基因含有34个外显子，编码1531个氨基酸的蛋白质，分子量为190kDa(éva Bakos et al.,2007)。该蛋白质具有3个疏水跨膜结构域(TMD)，也称为跨膜结构域(MSD)，称为TMD0(N-末端)，TMD1(中间)和TMD2(C-末端)(Met al.,2015)。ABCC1利用ATP结合/水解的能量作为主要的活性转运蛋白(Sharom et al.,2015)，ABCC1具有广泛的底物特异性，其过表达细胞能够运输大量底物，如抗叶酸药物，叶酸抗代谢物，蒽环霉素，长春花生物碱等(M et al.,2015)；无机阴离子，如亚砷酸盐和砷酸盐，ABCC1也是范围广泛的内源性化合物，包括谷胱甘肽(GSH)，葡糖醛酸和有机阴离子，如炎症介质白三烯C4硫酸盐共轭物的活性转运C4或雌二醇-17-β-d葡糖苷酸(E 217βG)。因此，ABCC1起着的有机阴离子，阴离子药物，异生素的缀合物泵出作用，由此ABCC1已被确定多特异性有机阴离子转运蛋白(MOATs)或谷胱甘肽结合物(GS-X)泵之一(éva Bakoset al.,2007，M et al.,2015，Lu et al.,2015，ConseilG et al.,2005))；所以ABCC1基因产物是机体排出药物保护正常细胞的关键基因之一。cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)，是核转录因子。该基因的交替剪接导致编码不同种型的几种转录物变体；作为转录激活因子，CREB1与启动子上的保守cAMP反应元件(CRE)结合，并介导对多种刺激的转录反应，包括激素，膜去极化，生长和神经营养因子，从而充当不同信号通路之间的介质(Xie et al.,2015)。近期研究发现，CREB蛋白水平在部分癌组织和细胞中呈高表达(Tan et al.,2012)，参与到肿瘤细胞的增殖、存活及转移等各个方面的调节。因此如何改造CREB1基因，构建一个可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体成为急需解决的一大难题，所以一种可增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体pcDNA3.1-FYJNa的应用利用对A549/DDP细胞进行总RNA提取后反转录为cDNA，在NCBI网站上找到CREB1基因的CDS区及对应的mRNA序列；根据引物设计原则用Primer 5.0软件设计引物，分别在上下游加上HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点；以人cDNA为模板进行PCR扩增CREB1基因CDS区；然后对CREB1基因CDS区的905、908、911和914位点进行突变；酶切pcDNA3.1(+)载体；连接目的片段与pcDNA3.1(+)；重组表达载体转化、检测与鉴定后将其命名为pcDNA3.1-FYJNa；突变信息如下：905的T突变为C；908的T突变为C；911的C突变为A；914的T突变为C即可得到；然后，分别通过qRT-PCR和Western blot法检测FYJNa和ABCC1基因mRNA和蛋白的表达水平，发明一种可显著增强细胞ABCC1基因表达的过表达载体FYJNa是必要的。

发明内容