[发明专利]一种利用荧光标记探针技术检测AHR基因多态性的方法

说明书

本发明公开了一种利用荧光标记探针技术检测AHR基因多态性的方法，包括以下步骤：确定AHR基因突变位点；根据突变位点设计并合成探针和引物；将被检测的AHR目标基因、探针、引物和酶混合进行荧光定量PCR，并监测荧光信号；计算杂交峰所显示的Tm值，根据Tm值判断AHR基因的类型。本发明操作简单，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点，通过直接探测PCR过程中荧光信号获得检测结果，基因分型清晰，不需要PCR后处理或电泳检测，可实现真正的闭管操作。

技术领域

本发明涉及一种AHR基因多态性的检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

乳腺癌是女性健康的巨大“头号杀手”，全球每年有50万妇女死于这种癌症。该病大多数发生在40-60岁，即更年期前后的妇女。全世界乳腺癌发生率正以每年0.2％-3％的幅度上升，2012年新增乳腺癌发病数170万。在欧美等西方发达国家，乳腺癌已成为妇女的主要死因之一，每8-10名妇女中，就有1人在其一生中将患乳腺癌。在我国，乳腺癌的发病率也呈逐年上升的趋势，达到 42.55/10万，在北京、上海、天津等大城市，乳腺癌已成为妇女恶性肿瘤发病的首位。散发性乳腺癌的发生不仅与个体遗传易感性有关，而且与某些环境因素如雌激素暴露水平、吸烟、婚育、哺乳、生活方式、饮食习惯等具有相关性。

芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)是一种配体激活转录因子，也是一种细胞信号通路的调节子。AHR可诱导许多外源化合物代谢酶的表达，还参与许多毒性反应和其他一些重要的生物学过程，如信号转导、细胞分化、细胞凋亡等。此外，AHR的基因多态性和化合物毒性作用与肿瘤易感性也有很重要的关系，在肿瘤的起始、进展和转移等过程中都起着重要作用。大量研究表明，活化的AHR可能参与了由多环芳烃诱导的乳腺癌的发生，而且AHR和细胞色素P450 1B1可能成为乳腺癌的分子生物标记。AHR基因多态性的研究有利于建立对个体发生散发性乳腺癌风险的评估，以便于实现早期预防和治疗。

目前普遍应用的突变检测方法为DNA直接测序法，PCR产物直接进行 DNA序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。

本发明利用一种可以特异识别核酸序列的荧光标记探针，通过与靶序列进行杂交后发生构象的变化而释放荧光染料，根据杂交后产生不同温度的峰图判定分型结果。在没有靶DNA存在的情况下，荧光基团与淬灭基团可以稳定地结合在一起，检测不到荧光信号；当有靶DNA存在时，荧光标记探针结构被破坏，荧光基团与淬灭基团相互分离，即可检测到荧光信号。该方法与其他遗传分型技术相比，操作简单，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点，通过直接探测PCR过程中荧光信号获得检测结果，基因分型清晰，不需要PCR后处理或电泳检测，可实现真正的闭管操作。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单易行的AHR基因多态性的检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供一种利用荧光标记探针技术检测AHR基因多态性的方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：采用硅胶吸附法抽提被测者口腔上皮细胞/外周血细胞样本的基因组 DNA，采用电泳凝胶成像法对DNA的浓度和纯度作检测，待测样本浓度标化到 10ng/ul；正常人样本DNA为阴性对照。

第二步：根据AHR基因多态性rs2066853，设计合成探针序列及引物，探针区15～33bp，环序列与靶DNA序列互补，确定最佳引物为40-45bp大小， PCR产物长度100-150bp。相关探针及引物信息如下：

rs2066853探针序列：

探针15′-CY5- CCATTTTGAAGACATCAGACACATGCAGAATGG-BHQ2-3′

rs2066853引物序列：