[发明专利]一种用于研究UVB照射致早衰的原代黑素细胞培养方法

说明书

一种用于研究UVB照射致早衰的原代黑素细胞培养方法，涉及放射生物学、细胞生物学技术领域。为了培养具有更高灵敏性的原代黑素细胞，本发明提供了下述方法：将包皮样本浸泡，剪去多余组织，将皮肤样本切成条状；转移到有盖器皿中，加入胰蛋白酶溶液在冰箱中孵育；分离真皮和表皮，将表皮转移到离心管中，室温下孵育、洗涤、离心；用黑素细胞培养基重悬沉淀，移至二氧化碳培养箱中继续后续培养。本发明方法较普通培养方法更加灵敏、适用性强，是用于不同剂量UVB照射原代黑素细胞实验研究的更优选择。

技术领域

本发明涉及放射生物学、细胞生物学技术领域，具体涉及一种用于研究UVB照射致早衰的原代黑素细胞培养方法。

背景技术

UVB照射：根据不同的生物效应，紫外线可按照波长被划分为四个波段，其中波长在290-320nm之间的波段被称为UVB波段，也称中波红斑效应紫外线。UVB具有中等穿透力，虽然大部分会被臭氧层吸收，但长期或者过量的照射可使皮肤变黑，引起红肿、脱皮等症状，对皮肤有一定的致癌性。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，紫外线辐射(波长100-400nm，包括UVA、UVB和UVC)被列为一类致癌物。人们日常所使用的防晒霜标识的SPF(sun protection factor)值即对于UVB防护的能力，因此应用UVB进行相应的研究有较高的实用性。

黑素细胞：黑素细胞(melanocyte)位于表皮的基底层，与表皮细胞共同组成表皮黑素单位，其主要功能是产生黑素小体防止皮肤受到损害。这些细胞位于皮肤的基底细胞层，但其分支位于基底细胞层以上的角质化细胞之间。黑素细胞的主要功能是产生黑色素，其对于皮肤的颜色起着十分重要的作用。同时，黑色素可以保护皮肤不受到紫外线辐射的损伤，其在免疫系统中也起到一定的作用。

细胞衰老：细胞是生物体结构和功能的基本单位，也是生物体衰老基本单位。细胞衰老在形态学上表现为细胞结构的退行性变；在生理学上的表现为功能衰退与代谢低下。细胞衰老分为复制衰老和早熟性衰老，前者为正常的生理性衰老；而后者则为病理性衰老(Cell,2017,170(4):816-816)。通常情况下，正常的生理性衰老对于机体是有益的，其可促进新陈代谢，减少有害物质的堆积。然而，病理性衰老是与临床上许多疾病的发生、发展相关而与年龄无关的生命体形态结构与生理功能的退变(才真和王春革,2014,医学综述,20(16):2994-2995)，大量研究表明，具有中等波长的紫外线B(Ultraviolet B UVB)可诱导细胞进入应激性早衰状态(J COSMET SCI,2005)，使黑素细胞(Melanocyte MC)周期滞于G1期，并能诱导P53的表达，促使黑素细胞早衰(Cancer Res,1995,55(18))。

目前学术界对于UVB照射原代黑素细胞的研究多在于导致其黑色素含量变化及阐明UVB对于黑色素合成相关分子的影响机制，研究UVB照射原代黑素细胞致其早衰有着相当重要的实质性意义，因此，培养具有更高灵敏性的原代黑素细胞具有重要意义。

发明内容

本发明是在普通用途原代黑素细胞培养方法的基础之上加以改进，提供了一种用于研究UVB照射致早衰的原代黑素细胞培养方法，包括如下步骤：

(1)将皮肤样本在乙醇中浸泡，取出后去除样本上残留乙醇；

(2)去除脂肪和皮下组织，将皮肤样本转移到有盖器皿中，加入胰蛋白酶溶液孵育过夜；

(3)孵育后，弃去消化液，用PBS溶液清洗皮肤样本，弃废液；

(4)分离皮肤真皮和表皮，将表皮置于PBS溶液中，室温下孵育30-60min，获得细胞悬液；

(5)将细胞悬液离心后弃去上清液，用PBS溶液洗涤沉淀；

(6)然后用黑素细胞培养基重悬沉淀，获得的重悬液移至培养器皿，置于二氧化碳培养箱中培养48-72h，获得原代黑素细胞；

(7)继续培养并定期更换培养液；