[发明专利]一种靶标间皮素的CAR-NK细胞制备方法

权利要求书

1.一种制备靶标间皮素的CAR-NK细胞的方法，包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到靶标间皮素的CAR-NK细胞；

所述融合蛋白为将NK细胞表面激活受体CD244的IgG样结构域更换为间皮素的特异性抗体后得到的重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将含有所述融合蛋白的编码基因的重组载体导入NK细胞，得到表达所述融合蛋白的NK细胞，即为所述靶标间皮素的CAR-NK细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白自N端到C端依次由CD244(2B4)的上膜信号区、单链抗体区和“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”组成。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述CD244(2B4)的上膜信号区的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位所示；所述单链抗体区的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第22-265位所示；所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的氨基酸序列为SEQID No.1的第266-420位所示；

进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

5.根据权利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因中编码所述CD244(2B4)的上膜信号区的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-63位所示；所述融合蛋白的编码基因中编码所述单链抗体区的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第64-795位所示；所述融合蛋白的编码基因中编码所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第796-1263位所示；

进一步地，所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求2至5中任一所述的方法，其特征在于：所述重组载体为重组慢病毒载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(a)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，进行培养，获得重组慢病毒；

(b)将所述重组慢病毒感染NK细胞，从而获得所述靶标间皮素的CAR-NK细胞。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述重组慢病毒载体为将SEQ ID No.2所示的所述融合蛋白的编码基因插入到plenti慢病毒载体的多克隆位点之间后得到的重组质粒；和/或所述慢病毒包装质粒为PspaX2质粒和PMD2.0G质粒；和/或所述慢病毒包装细胞为293T细胞。

9.如下任一所示生物材料：

(a1)利用权利要求1至8任一所述方法制备得到的靶标间皮素的CAR-NK细胞；

(a2)权利要求1至8中任一所述融合蛋白；

(a3)权利要求1至8中任一所述融合蛋白的编码基因；

(a4)含有权利要求1至8中任一所述融合蛋白的编码基因的重组载体、表达盒、重组菌或重组细胞；

进一步地，所述重组载体为权利要求2至8中任一所述的重组载体。

10.如下任一所示应用：

(A1)权利要求9中所述的靶标间皮素的CAR-NK细胞在制备用于治疗间皮素过量表达的肿瘤的产品中的应用；

(A2)权利要求9中所述的靶标间皮素的CAR-NK细胞在制备用于杀伤间皮素过量表达的肿瘤细胞的产品中的应用；

(A3)权利要求9中所述的编码基因、重组载体或表达盒在制备所述靶标间皮素的CAR-NK细胞中的应用；

进一步地，所述间皮素过量表达的肿瘤为卵巢癌或胰腺癌；所述间皮素过量表达的肿瘤细胞为卵巢癌肿瘤细胞或胰腺癌肿瘤细胞。