[发明专利]斑马鱼糖原贮积症gys1和gys2基因突变体的构建方法

权利要求书

1.斑马鱼糖原贮积症gys1基因突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选择斑马鱼gys1基因序列的第四个外显子序列设计gys1基因敲除的靶点，序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)根据步骤(1)中gys1基因敲除的靶点序列设计扩增引物，包括：所述gys1基因敲除的上游特异引物序列如SEQ ID NO.3所示，所述gys1基因敲除的下游通用引物序列如SEQID NO.5所示；

(3)以序列如SEQ ID NO.6所示的pUC19-scaffold plasmid为模板，用步骤(2)中所述扩增引物进行PCR扩增；

(4)对步骤(3)中PCR产物进行纯化，体外转录，获得斑马鱼gys1基因敲除靶点gRNA，所述斑马鱼gys1基因敲除靶点gRNA的序列如SEQ ID NO.7所示；

(5)将步骤(4)获得的靶点gRNA与Cas9蛋白导入斑马鱼受精卵中，将终浓度为80-100ng/μL的gRNA与终浓度为800ng/μL的Cas9蛋白按比例混合，显微注射到斑马鱼一细胞期胚胎中；

(6)培养获得稳定遗传的斑马鱼gys1基因纯合突变体。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(6)中，斑马鱼gys1基因纯合突变体的培养方法为：

(ⅰ)导入gRNA和Cas9蛋白的斑马鱼胚胎48hpf后，进行gys1基因敲除效率检测，确定gys1 F₀靶点突变效率，所述斑马鱼gys1基因敲除检测采用的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；

(ⅱ)将gys1 F₀基因检测敲除成功的成鱼与野生型斑马鱼外交，得到F₁胚胎，经基因型鉴定获得gys1 F₁杂合突变体斑马鱼；

(ⅲ)将相同突变类型的gys1 F₁杂合突变体斑马鱼成鱼内交，获得gys1 F₂突变体斑马鱼；

(ⅳ)鉴定为F₂中gys1基因敲除的纯合子，即所述稳定遗传的斑马鱼gys1基因纯合突变体。