[发明专利]SADS-CoV的荧光RT-PCR引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了SADS‑CoV的荧光RT‑PCR引物组、试剂盒及方法。本发明设计了一套特异性引物和探针，应用本发明的特异性引物和探针的荧光RT‑PCR方法和试剂盒能够实现快速鉴别SADS‑CoV的目的，检测最低浓度为10copies/μL数量级且检测结果十分稳定，具有特异性强，扩增效率高和灵敏度高的优点。

技术领域

本发明涉及一种荧光RT-PCR检测技术领域，具体涉及SADS-CoV的荧光RT-PCR引物组、试剂盒及方法。

背景技术

猪急性腹泻综合征(Swine acute Diarrhoea Syndrome，SADS)是由猪急性腹泻综合症冠状病毒(swine acute diarrheasyndrome coronavirus，SADS-CoV)引起的会导致猪急性呕吐和严重水样腹泻的疾病。2016年10月至2017年5月，该病毒在广东清远地区已经导致4个养殖场的24693头仔猪死亡，其中5日龄以下的仔猪死亡率高达90％。发病仔猪表现为严重急性腹泻、呕吐、体重迅速下降，与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)等引起的临床症状极为相似，一般方法无法分辨。

随着时间的发展，SADS-CoV可能会为养猪业带来重大的经济损失，对该病毒快速有效的检测是防控和减少经济损失的重要一环。在当前分子生物学的研究领域中，相对于普通PCR技术，荧光PCR技术得益于探针的加入，能够通过荧光信号实时监测PCR产物每个循环的积累总量，具有更强的特异性和更高的灵敏度，能够对含量低(例如样品中含有的病毒)的样品进行准确鉴定，同时无需电泳，缩减实验时间和减少产物污染，目前国内外尚无利用该技术检测SADS-CoV核酸的的相关报道。

发明内容

为了解决上述现有技术问题，本发明的目的是提供SADS-CoV的荧光RT-PCR引物、探针、试剂盒及方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种用于检测SADS-CoV的荧光RT-PCR引物组，

包括用于检测SADS-CoV的引物对和探针，其序列为：

上游引物F：5'-CAGACACCACGTGAACAATACC-3'(SEQ ID NO:1)，

下游引物R：5'-TCCATAGCTCCCAAGTCAAAT-3'(SEQ ID NO:2)，

探针P：5'-TAGCTGTTTCGCCCATTCACGTTACG-3'(SEQ ID NO:3)。

优选地，所述探针P使用FAM为荧光基团，BHQ1为荧光猝灭基团。

上述的用于检测SADS-CoV的荧光RT-PCR引物组能够用于制备检测SADS-CoV的试剂。

本发明还提供了一种用于检测SADS-CoV的荧光RT-PCR方法，包括以下步骤：

步骤1：合成上述的用于检测SADS-CoV的荧光RT-PCR引物组；

步骤2：提取待检测样品的总RNA，然后以提取的总RNA为模板使用荧光RT-PCR引物、探针进行PCR扩增反应和荧光收集；

步骤3：根据PCR扩增反应和荧光值，进行结果判定。

本发明还提供了一种包含上述的用于检测SADS-CoV的荧光RT-PCR引物组的试剂盒，试剂盒还包含TaKaRa Ex Taq酶、PrimeScript RT Enzyme酶、2×One Step RT-PCRBuffer、阳性对照和DEPC水。

优选地，所述阳性对照为SADS-CoV合成质粒，所述DEPC水同时还作为阴性对照。