[发明专利]CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法

说明书

为了解决猪Fah、Rag2双基因敲除效率低、筛选困难的问题，本发明提供了一组Fah、Rag2双基因的靶序列，以及它们在CRISPR‑Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的用途。本发明还提供了一种CRISPR‑Cas9敲除猪Fah、Rag2双基因的方法。通过验证，本发明可以有效实现猪Fah、Rag2双基因的敲除，其双敲除效率高达50％，筛选也十分简单。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，尤其涉及一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah、Rag2双基因的方法。

背景技术

我国是肝病大国，是世界上病毒性肝炎和肝癌发病率最高、患者最多的国家。目前，全国慢性肝病患者3000万人，每年死于肝癌的病人50多万，每年用于肝病的治疗费用达1000亿元人民币。肝移植仍是目前治疗肝功能衰竭最有效的手段，但供体的短缺和移植后终生免疫抑制剂治疗严重地限制了肝移植在临床上的应用。寻找全肝或部分肝移植的替代治疗方案是临床的迫切需求。因此，肝细胞移植(Hepatocyte transplantation，HT)、生物人工肝(Bioartificial liver，BAL)及组织工程肝脏(Tissue engineered liver，TEL)等作为肝移植的替代、过渡支持或补充手段引起广泛关注，临床医生希望通过这些支持治疗手段使病人能够通过肝再生自行恢复而避免进行肝移植。

研究者将人源肝细胞植入Fab和Rag2基因双敲除(Fah^-/-Rag2^-/-)的小鼠体内，使人源肝细胞快速增殖，并逐渐替换掉小鼠自身肝细胞，以期获得更多有功能的肝细胞。前述的基因中，Fah编码的延胡索酰乙酰乙酸水解酶是酪氨酸分解代谢的关键的酶，缺失Fah基因会引起严重的肝损伤，致使肝细胞凋亡；而Rag2基因的缺失可能导致V(D)J的重排缺陷，导致严重的联合免疫缺陷(SCID)，减少小鼠对人肝细胞的排斥反应。人源肝细胞由于具有代谢酪氨酸的能力，在免疫力低下的Fah^-/-Rag2^-/-小鼠体内免受免疫系统的清除，逐渐增殖，代替小鼠肝细行使功能。按照这个原理，每只小鼠产生的人肝细胞少于1×10⁸个，不足以用作肝细胞移植和生物人工肝治疗。

而猪在解剖，生理病理学，营养代谢和疾病特征等方面都与人类相似度更高，根据生物安全性、生理功能指标等多方面评价，基因修饰猪已然成为疾病发生机制，病理毒理研究，异种细胞再生系统，异种器官来源等多方面的重要动物模型。若使用Fah^-/-Rag2^-/-的猪代替Fah^-/-Rag2^-/-的小鼠，则可提供足量的干细胞用于肝细胞移植和生物人工肝治疗。

CRISPR-Cas9技术是一种新型的基因组靶向修饰技术，可以对生物体基因组特异位点进行定点改造，比起传统基因编辑技术(如同源重组技术、类转录激活效应子核酸酶技术、锌指核酸酶技术等)有着操作简单、成本低等优势，但由于其脱靶率较高，且十分依赖精确的sgRNA靶序列设计。通常情况下，CRISPR-Cas9技术进行基因敲除，其单等位基因敲除率可能达到80％以上，但双等位基因敲除成功率在10％以内。例如：J-T Kang的研究中，对猪纤维原细胞的RUNX3基因进行CRISPR-Cas9敲除，其双等位基因突变率仅有7.8％(Generaton of RUNX3 knockout pigs using CRISPR/Cas9-mediated genetargeting.Reprod Dom Anim 2016；51：970-978)。

目前尚未见报道使用该技术对猪的Fah和Rag2基因进行双敲除。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Fah基因的靶序列，所述序列如SEQ ID NO.17所示。

本发明还提供了一种CRISPR-Cas9特异性敲除猪Rag2基因的靶序列，所述序列如SEQ ID NO.51所示。