[发明专利]一种鉴定肠道微生态状态的引物组合物及其应用

说明书

本发明提供了一种鉴定肠道微生态状态的引物组合物及其应用，所述引物组合物为针对肠道细菌的16S rRNA设计的特异性引物，所述特异性引物包括随机碱基，所述随机碱基的个数为3‑5个；所述肠道细菌包括共生梭菌、青春双歧杆菌、具核梭杆菌、厌氧消化链球菌或克雷伯氏菌属中的任意一种或至少两种的组合。基于本发明的引物组合物研发的试剂盒，检测肠道微生态失衡的特异性高达92.5％，灵敏度高达80.43％。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种引物组合物及其应用，主要涉及一种鉴定肠道微生态状态的引物组合物及其应用，特别涉及一种鉴定肠道微生态状态的引物组合物组合物及其制备得到的试剂盒。

背景技术

近年来，肠道疾病发病率不断攀升，且肠道疾病早期症状不明显，缺乏有效的筛查方法，最终有可能发展成为癌症。现有技术对肠道疾病的检查和筛选主要通过粪便隐血实验初步筛查高危人群，再进行肠镜检查。然而粪便隐血实验缺乏特异性，初筛顺应性及高危人群的肠镜受检率仅30-40％，疾病检出率19％左右，有待进一步提高。利用无创的标志物对人群进行筛查，可缩小肠镜检查人数，进一步提高肠镜的特异性及灵敏度，对早期筛查肠道疾病有重要的临床意义。

人的肠道内存在大量菌群，有益菌和条件致病菌共存，健康人的体内有益菌占优势，菌群数量维持平衡的稳态；但患有肠道疾病的人体内，体内环境发生变化，导致菌群失衡，条件致病菌数量显著增加，因此，通过鉴定肠道内菌群微生态可以对肠道疾病作出预警。

CN108690864A公开了一种个体粪便样本中菌群平衡关系指标的计算方法，及其在结直肠癌(CRC)中的筛查、诊断或辅助诊断中的应用。通过提取粪便中细菌的DNA测序获得细菌种类和数量的特征，并以多种细菌的数量比值特征为基础进行CRC的诊断。与目前已用于临床或申请专利的无创性筛选CRC的方法相比，该发明完全无创，而且能更准确的诊断CRC。分析结果显示，具核梭杆菌Fn与双歧杆菌Bb数量的比值(Fn/Bb)对于筛查出CRC具有较高的敏感度和特异性，分别达到84.6％和92.3％(AUC＝0.911)。进一步联合具核梭杆菌Fn与柔嫩梭菌Fp数量的比值(Fn/Fp)提高了对CRC的诊断价值，其受试者工作特征曲线的曲线下面积达到了0.943。此外，Fn/Bb和Fn/Fp数量比值的联合筛查I期CRC具有60％的特异性和90％的敏感性。但该方法操作复杂，检测灵敏度不高。

CN105803061A公开了一种用于检测共生梭菌的试剂在制备早期大肠癌诊断试剂盒中的应用。该试剂盒通过提取粪便中细菌的DNA并进行定量聚合酶链式反应从而获得共生梭菌的相对丰度的特征，并以该特征为基础进行早期大肠癌(局限于粘膜下层的结肠癌和直肠癌)的诊断。该发明完全无创，操作相对简易廉价，而且能更准确的预测诊断大肠癌，其ROC曲线下面积(AUC值)在0.70以上。但该方法局限性强，无法预知肠道微生态的整体情况。

因此，提供一种高效，便捷，灵敏度高的用于鉴定肠道微生态状态的引物组合物具有重要意义和广阔应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种引物组合物及其应用，本发明的引物组合物包含针对五种特定微生物的特异性引物，通过加入随机碱基，显著增强引物的特异性，提高引物组合物对微生态菌群的鉴定作用，具有重要意义和广阔应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种鉴定肠道微生态状态的引物组合物，所述引物组合物为针对肠道细菌的16S rRNA设计的特异性引物，所述特异性引物包括随机碱基，所述随机碱基的个数为3-5个；所述肠道细菌包括共生梭菌、青春双歧杆菌、具核梭杆菌、厌氧消化链球菌或克雷伯氏菌属中的任意一种或至少两种的组合。

本发明的引物组合物针对特定肠道细菌的16S rRNA设计特异性引物，通过加入随机碱基，调控随机碱基的数量，提高检测特异性，高效便捷地鉴定肠道微生态状态。