[发明专利]一种用于风信子属植物根尖染色体荧光原位杂交染色体制片的处理方法

权利要求书

1.一种用于风信子属植物根尖染色体荧光原位杂交的染色体制片的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

一、风信子染色体制片；

（1）选取水培风信子根尖，当水培根系长达1cm时，在9:00-11:00剪取水培根尖放入10ml盛有预处理液的离心管中，进行预处理；

（2）预处理液由0.2％秋水仙素与0.002 M 8-羟基喹啉混合液1:1配制而成，处理20 h后转至卡诺氏固定液I固定24 h，4℃贮存备用，固定液I为无水乙醇：冰乙酸的体积比3:1；

（3）随机选取风信子品种各10条根，45%乙酸解离1.5-2h；

（4）45%乙酸压片：取一条解离后的根，先切去根冠，再将分生区域横切为0.1 mm的薄片，取三张薄片平置于一片一侧带毛边的干净载玻片上，滴一滴45%乙酸溶液，20mm× 20mm的盖玻片盖片，压住盖片一角，用解剖针垂直敲击分生薄片区域，待根切片全部分散，酒精灯烤片至雾气将散，滤纸吸干，垂直用力压片；

（5）Olympus BX41相差显微镜镜检，选取分裂相较好的染色体制片备用；

（6）揭片：①冷冻揭片，超低温冰箱-70℃冷冻过夜；②液氮揭片，液氮处理30秒，揭片后立即放入无水乙醇脱水半小时以上，气干，室温贮藏备用；

二、染色体制片处理：染色体制片处理液配制，染色体制片处理；

所述的染色体制片处理液配制的步骤为：

（1）RNA酶A：浓度25mg/mL，用1×TE 进行溶解，-20℃保存备用，使用前用2×SSC稀释至终浓度50μg/μL；

（2）4%胃蛋白酶：用0 .1 mol/L HCl进行溶解，4℃保存，使用前用0 .1 mol/L HCl稀释至终浓度50 mg/ml；

（3）4%多聚甲醛：ddH₂O 900µl和1mol/L NaOH 500µl加热至65～70℃，加入多聚甲醛40g，加热并搅拌直到充分溶解，冷却至室温，加入100µl 10×PBS，加HCl调至pH7.3，抽虑灭菌后分装，4℃避光保存；

所述的染色体制片处理的步骤为：

将染色体制片置于50 μg/μL RNA酶A的2×SSC溶液中，37℃酶解 30-40 min；转入4%胃蛋白酶的0 .1 mol/L盐酸溶液中，37℃酶解6-8 min；再转入4%多聚甲醛溶液中，室温避光处理10 min；然后70%、95%、100%乙醇中梯度脱水各3 min，气干，室温贮藏备用，处理过程中要保证染色体标本全部浸在处理液中；

所述的染色体为5S rDNA。