[发明专利]稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法

说明书

本发明公开了一种稳定表达FGF‑1蛋白细胞株的构建方法。在pLenti‑CMV‑Gag‑Mcherry‑Puro载体的Not I和Avr II多克隆位点处插入FGF‑1基因，用构建好的pLenti‑CMV‑FGF‑1‑Emcherry‑Puro重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，培养、出毒、收取病毒上清、过滤得重组慢病毒液。将包装好的重组慢病毒感染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选及鉴定，得稳定表达FGF‑1蛋白细胞株。本发明利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达FGF‑1蛋白的细胞株，该细胞株为研究FGF‑1蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。

技术领域

本发明设计医学分子生物学技术领域，尤其是一种稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法。

背景技术

目前，全球超过4亿成人患有糖尿病，估计未来10年会增加到6亿人以上。糖尿病是一种受遗传、环境和生活习惯综合影响导致的慢性代谢疾病，主要分为胰岛素依赖型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)、非胰岛素依赖型糖尿病(type 2 diabetesmellitus，T2DM)和妊娠期糖尿病。其临床表现为人体自身不能产生胰岛素或者不能利用胰岛素，导致血糖高于正常血糖范围，从而引起一些并发性疾病。糖尿病及其并发症降低了患者的预期寿命和生活质量，而且每年糖尿病的死亡率、发病率和相关的卫生保健支出都在逐步上升。常规糖尿病治疗药物大多存在疗效不持久、副作用较多及易出现胰岛素耐受等弊端。因此，迫切需要研发更有效与更安全的糖尿病治疗药物。

2014年，发现新型的调节血糖因子——酸性成纤维细胞生长因子(acidicfibroblast growth factor，aFGF或FGF1)，同时具备胰岛素增敏效果，为治疗胰岛素抵抗的T2DM带来了新的希望。近年来，FGF1作为胰岛素增敏剂的发现，在显著降低血糖、改善胰岛素抵抗、减少副作用方面已被证实。并且，结构优化后的重组FGF1蛋白促有丝分裂的能力更低。因此，比野生型FGF1在实验动物体内代谢作用更为有效。和临床降糖药相比，作用持续时间更长、安全性更高；在治疗T2DM方面，FGF1与FGF家族的其他成员相比，有着特异性降糖作用。

发明内容

本发明的目的是：提供一种稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法，利用重组慢病毒系统制备一种融合标签蛋白并能稳定表达FGF-1蛋白的细胞株，该细胞株为研究FGF-1蛋白的生物学功能提供一个很好的工具。

本发明是这样实现的：稳定表达FGF-1蛋白细胞株的构建方法，包括如下步骤：

1)FGF-1基因的扩增；

2)将FGF-1基因与载体pLenti-CMV-Gag-Mcherry-Puro(购自北京基石生命科技有限公司)连接，构建重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro；

3)将重组慢病毒表达质粒pLenti-CMV-FGF-1-Emcherry-Puro与慢病毒包装质粒psPAX2及pVSV-G共转染293T细胞，48h后，收集上清，72000×g离心4h获得高度浓缩的慢病毒颗粒；

4)将包装好的重组慢病毒CMV-mcherry-LVP转染293T细胞，通过嘌呤霉素筛选阳性细胞株，对阳性细胞株进行细胞免疫荧光鉴定，获得稳定表达FGF-1蛋白细胞株。

所述的步骤1)具体是，以FGF-1-F和FGF-1-R为特异性引物，添加酶切位点Not I和Avr II，以质粒pEmcherry-N1-FGF-1为模板，进行PCR扩增；所述的特异性引物FGF-1-F的序列如序列表SEQ ID 1所示，FGF-1-R的序列如序列表SEQ ID 2所示。

PCR扩增体系为：PCR反应程序：94℃变性2min，56℃复性1min，72℃延伸2min，共循环30次，最后72℃再延伸10min。PCR结束后，取2μl扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，分离、回收纯化。