[发明专利]一种乳粉中游离唾液酸的检测方法

说明书

本发明涉及乳粉的质量控制领域，具体涉及一种乳粉中游离唾液酸的检测方法，包括如下步骤，将提取得到的游离唾液酸用邻苯二胺进行衍生化，然后利用高效液相色谱进行检测；衍生化的反应体系中添加含有亚硫酸基团的抗氧剂，高效液相色谱检测的过程中以硫酸和乙腈的混合液作为流动相。本发明用硫酸与乙腈的混合液作为流动相，硫酸中的杂质含量少，检测的过程中杂峰少，可保证检测的准确性。为进一步地提高检测的准确性，本申请在衍生化体系中添加含有亚硫酸基团的抗氧化剂，这种抗氧化剂的添加既可防止邻苯二胺因氧化而导致副反应的发生，而且它被被氧化后转化成硫酸根，与液相检测中的流动相相同，有利于进行准确地检测。

技术领域

本发明涉及乳粉的质量控制领域，具体涉及一种乳粉中游离唾液酸的检测方法。

背景技术

唾液酸(SA)，化学名为“N-乙酰基神经氨酸”，具有吡喃糖结构，是一种天然的碳水化合物，在人体的脑组织中唾液酸含量最高。唾液酸通常以低聚糖、糖脂或者糖蛋白的形式存在。唾液酸广泛存在于多种生物组织中，是构成细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分。在大部分哺乳动物组织中，发现的唾液酸主要是N-乙酰神经氨酸，所以通常把N-乙酰神经氨酸称为唾液酸，它参与细胞表面的多种生理活性。另外，唾液酸是一种天然的大脑营养素，它能促进婴儿的记忆力和智力发育，因此，唾液酸被添加在很多婴幼儿奶粉中。

当前SA含量分析的方法研究主要有直接法和间接法。直接法以GB/T 30636-2014和药典方法为代表。首先对样品(燕窝或者乳粉)在一定浓度的酸性条件下使SA游离出来，获得含SA的样品液，离心取上清，采用离子交换型有机酸树脂液相色谱柱进行紫外检测。但是该法对唾液酸及其相关低聚糖无法有效区分：唾液酸和唾液酸低聚糖都含有游离羧基，利用离子交换型的有机酸树脂无法有效分离唾液酸和唾液酸低聚糖，产生检测含量比实际含量高的误差。对于唾液酸含量少的蛋白产品(如乳粉等)则无法有效测量。

间接法通过衍生试剂对SA进行衍生化产生荧光标记，采用反相色谱柱，在合适的色谱条件下分离，用激发波长激发衍生物，衍生物产生发射波长，利用发射波长检测衍生物。衍生试剂的代表有二氨基亚甲基二氧基苯(DMB)及间苯二酚(DBS)等。间接法的存在如下缺点：1)衍生试剂易被氧化，在衍生时不加保护剂，容易造成衍生试剂自氧化而引入干扰物质；2)流动相为：1.0％的四氢呋喃水溶液(含质量分数0.2％磷酸)-乙腈(92∶8)。四氢呋喃易氧化，它作为流动相使用的过程中自身带有的抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，也会引入不必要的干扰物；3)样品制样时引入有机溶剂，在色谱分离时产生溶剂效应，导致检测样品的保留时间发生漂移；4)处理后的样品含有蛋白杂质，会影响干扰检测，并缩短色谱柱寿命。

综上所述，本领域缺乏对乳粉制品中游离唾液酸进行检测的方法。在乳粉中添加SA后，由于乳粉中含有唾液酸的低聚糖、糖脂或者糖蛋白以及大量的水溶性蛋白，游离SA的检测更加复杂。当前乳粉中游离唾液酸的准确的检测方法几乎缺失。为了克服乳粉种游离唾液酸干扰物多(尤其是不受唾液酸低聚糖等唾液酸衍生物的干扰)的问题，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳粉中唾液酸的检测方法，包括如下步骤：将提取得到的游离唾液酸用邻苯二胺进行衍生化，然后利用高效液相色谱进行检测；

衍生化的反应体系中添加含有亚硫酸基团的抗氧剂，高效液相色谱检测的过程中以硫酸和乙腈的混合液作为流动相。

唾液酸是含有吡喃糖环的天然产物，在溶液中存在椅式构象和链式构象的构象转化平衡。链式构象是一种邻酮酸活性结构，有酮酸构象的唾液酸与邻苯二胺在酸性条件下发生脱水缩合反应，生成苯并喹喔啉类的唾液酸衍生物，唾液酸的衍生物具有强紫外吸收的特性，可进行进一步的检测。