[发明专利]一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用

说明书

本发明公开了一种检测水稻条纹花叶病毒(RSMV)的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用。利用抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体1D4建立成快速灵敏、简单方便、准确高效地检测水稻和传毒介体电光叶蝉体内RSMV的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹血清学检测技术，并开发成快速检测试剂盒。该斑点免疫印迹检测技术检测感染RSMV水稻病叶和携带RSMV电光叶蝉的灵敏度分别达到1:40960(w/v,g/mL)和1:5120倍稀释(单头/μL)。此简单快速、灵敏特异、准确高效的RSMV检测技术及其检测试剂盒为水稻条纹花叶病的快速诊断、抗病育种、预测预警及科学防控提供技术和物质支撑。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法及其应用。

背景技术

水稻病毒病是水稻植物重要病害之一，每年对我国水稻产量造成了严重损失。2015年，在广东省罗定市田间发现了一种新的水稻病毒病害，它的症状不同于已报道各种水稻病毒病，其为弹状病毒科细胞质弹状病毒属一个新种，命名为水稻条纹花叶病毒(Ricestripe mosaic virus,RSMV)。就目前所知，该病毒是迄今为止唯一自然侵染水稻的细胞质弹状病毒，也是首个经电光叶蝉传播的细胞质弹状病毒。RSMV感染植株轻度矮缩，叶片呈条纹花叶状，且有部分病叶表现扭曲，病株可抽穗，但抽穗不完全且籽粒空瘪。3叶期稻苗经电光叶蝉传毒接种后10天，新叶出现明显黄色条纹，随后叶片表现为花叶，叶尖向内侧卷曲。

RSMV病毒粒子呈杆状，在叶肉细胞及维管束系统细胞质中聚集并形成大量的晶格状，几乎充满整个细胞质空间，而细胞核内未观察到病毒粒子。有些病毒粒子聚集在囊泡内。在RSMV基因组的互补链上预测有7个ORFs，推测这7个ORFs的编码蛋白与多数弹状病毒的编码蛋白相似，ORF1预测编码病毒 N蛋白；ORF2编码病毒的P蛋白；ORF3编码蛋白是一个碱性的膜蛋白，且该蛋白可能具有运动蛋白的功能；ORF4推测编码M蛋白；ORF5预测编码病毒G 蛋白；ORF6推测编码一个辅助蛋白；ORF7预测编码病毒的L蛋白。RSMV的传播介体是电光叶蝉，其能以高效持久的方式传播RSMV。

目前，根据症状观察判断田间水稻条纹花叶病毒的发生情况仍然是最主要的方法，但病毒侵染前期水稻没有任何症状，且多种病毒病造成的症状极为相似，另外，常有病毒复合侵染情况，因此依靠症状观察得到的结果缺乏准确性和科学性。电镜观察病毒粒子需要昂贵的仪器，且有些不同病毒粒子的大小和形态有相似性，导致其仅作为一种辅助检测手段。基于PCR方法的分子检测技术虽然灵敏，但是不适于大规模样品的检测，仅适合实验室对小样本的检测。而血清学方法简单易操作、快速、灵敏、成本较低，且适用于田间样品的大规模检测，是目前理想的植物病毒的检测技术。为此，本发明专利利用胶体金标记的申请人已申请专利申请号为201810134449.5的单抗1D4，成功建立检测该病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹检测技术及其检测试剂盒，从而为我国水稻条纹花叶病毒的检测诊断、预测预警、抗病育种及科学防控提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹技术及其应用。

一种检测水稻条纹花叶病毒的基于免疫胶体金的斑点免疫印迹方法，具体为：用胶体金标记抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4作为检测抗体；所述的抗水稻条纹花叶病毒的特异性单抗1D4由杂交瘤细胞株分泌，该杂交瘤细胞株于2017年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14898。

其中，用胶体金标记抗体包括如下步骤：

1)胶体金溶液制备：将100mL 0.01％氯金酸加热至沸腾，加入1.2mL 1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min后氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

2)取50mL所述胶体金溶液，用0.1M K₂CO₃将其pH值调至8.2；