[发明专利]一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于，免疫胶体金垫采用吸附有胶体金标记抗水稻条纹病毒单抗的聚酯膜，硝酸纤维素膜的检测线即T线上结合抗水稻条纹病毒单抗，质控线即C线上结合有羊抗鼠IgG。

2.如权利要求1所述的快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于能准确、特异、灵敏地检测水稻、小麦和灰飞虱体内的水稻条纹病毒，且其检测水稻病叶组织粗提液的灵敏度达到1:20,480倍稀释，单位为克/mL，检测单头携毒灰飞虱的灵敏度达到1:5,120倍稀释，单位为头/μL。

3.如权利要求1所述的快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于该试纸条检测感染水稻条纹病毒的水稻、小麦和灰飞虱样品呈强阳性结果，而检测感染水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒、水稻齿叶矮缩病毒、水稻矮缩病毒、水稻条纹花叶病毒、水稻瘤矮病毒的水稻和健康水稻及感染中国小麦花叶病毒、小麦黄花叶病毒、小麦矮缩病毒的小麦和健康小麦、无RSV病毒的灰飞虱、携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱、携带水稻条纹花叶病毒或水稻瘤矮病毒电光叶蝉、携带水稻齿叶矮缩病毒褐飞虱均呈阴性结果。

4.一种快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)胶体金溶液制备：将50mL 0.01％氯金酸加热沸腾，加入0.55mL 1％柠檬酸三钠后混匀，再保持沸腾30min，氯金酸还原成胶体金颗粒溶液；

2)水稻条纹病毒免疫胶体金溶液制备：取50mL所述胶体金溶液，用0.1M K₂CO₃将其pH值调至7.8，边搅拌边加入2mL 1mg/mL的抗水稻条纹病毒单抗，搅拌30min；再逐滴加入1mL25M分子量为20000的聚乙二醇即PEG溶液，再搅拌15min；4℃20000rpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7.4且含0.4M PEG 20000的PBS缓冲液悬浮，4℃20000rpm离心15min，去上清，沉淀重复用PBS缓冲液悬浮、离心，再用5mL pH 7.4且含2％BSA的PBS缓冲液溶解沉淀，用0.22μm无菌过滤器过滤后，滤液即为免疫胶体金溶液，于4℃保存备用；

3)将上述水稻条纹病毒免疫胶体金溶液用含30％蔗糖的0.01M pH 7.4 PBS缓冲液稀释8倍，用喷金机按2.3μL/cm的喷金量喷涂到聚酯膜标记垫上，形成水稻条纹病毒免疫胶体金垫；

4)将1.0mg/mL抗水稻条纹病毒单抗用含5％蔗糖的0.01M pH 7.4 PBS缓冲液稀释6倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜检测线即T线上；1.2mg/mL的羊抗鼠IgG用含2％蔗糖的0.01MpH 7.4 PBS缓冲液稀释5倍，用划膜机点在硝酸纤维素膜质控线即C线上，使T线和C线相距5mm；

5)将吸水滤纸制成的样品垫、水稻条纹病毒免疫胶体金垫、点有T线和C线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴到PVC胶板上，然后切割成60mm×3mm的条带后组装成试纸条。

5.如权利要求4所述快速检测水稻条纹病毒的胶体金免疫试纸条的制备方法，其特征在于，所述的水稻条纹病毒单抗通过如下方法制备：从感染水稻条纹病毒的水稻植物组织中提纯病毒粒子作为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、细胞克隆杂交瘤技术获得抗RSV单克隆抗体。