[发明专利]一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法

说明书

本发明公开了一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法，属于化学分析检测领域。本发明开发了一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的前处理方法，通过对提取溶剂的选择优化，利用乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液作为提取液，得到一种通用性强、提取充分、提取选择性高、重现性好的样品前处理方法。本发明方法在低温条件下对线虫样品代谢物进行充分的提取，可降低高温条件对代谢物结构的影响，通过除去脂溶性的次级代谢物避免了次级代谢物对仪器的污染干扰，所得的代谢物峰数据丰富。该方法可应用于以线虫为研究模型的现代发育生物学、遗传学、基因组学、环境毒理学等研究中，特别是以GC‑MS作为分析工具的代谢组学研究。

技术领域

本发明涉及一种用于秀丽隐杆线虫代谢组学分析的样品前处理方法，属于化学分析检测领域。

背景技术

秀丽隐杆线虫(C.elegans)是一种生长在土壤中的成虫体长约1-1.5mm的新模式生物，主要以细菌为食物，具有体积小、容易培养、生长周期短、保存简便等特点。秀丽隐杆线虫拥有高等生物衰老的一般性特征，如行动力减缓、肌肉萎缩等，是近年来衰老研究中最重要的非脊椎类模式生物之一。研究数据表明，线虫高度类似哺乳动物，至少38％的线虫蛋白表达基因被证明与人类基因有直接同源性，60％-80％的人类基因均可在线虫基因组中找到同源基因，其中含与人类疾病相关的40％比例的基因。因此，秀丽线虫被广泛应用于现代发育生物学、遗传学、基因组学、环境毒理学等研究中，而在毒理评价以及药物筛选中应用最为广泛。

代谢组学(Metabonomics/mebabolomics)是研究生物体系在受到外界不同刺激或干扰(基因改造或外部环境变化等)前后等特定条件下的代谢产物(分子量<1000)的种类、数量和变化规律的科学，能够分析机体局部的一条代谢通路，是一种新型的系统生物学重要组成部分。代谢组学与其它组学相比，可以从代谢物层面上对生命活动进行探究，通过分析内源性代谢物的调节以及与整体生物学状况的关系，找出生物标记物，从而找出外界环境对引起生物体变化的可能途径。因此，通过对线虫代谢组研究，不仅可以了解线虫在不同环境条件下的变化，还可以进行以线虫为载体在药物等物质暴露条件下的毒理以及功效等的评价，并提供准确的代谢物组分和含量。

高通量的代谢组学研究要求检测分析技术具有高灵敏度、高分辨率、无偏性和良好的重现性。气相色谱质谱联用仪(GC-MS)是基于质谱的主要检测平台之一，是代谢组学研究中应用最早的分析技术，也是最为成熟的色谱-质谱联用技术之一，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、重现性好、有较高的分析速度、标准代谢物图库丰富等优点，在分析相对分子质量小、极性和沸点低的代谢物或衍生化后在具有挥发性的物质有明显优势。此外，GC-MS仪器相对便宜，且有较为完整的人体代谢质谱数据库(HMDB)，物质鉴定起来相对便捷，尤其适用于分析多组分混合物中未知成分的定性分析，可准确判断化合物的分子式，能够鉴别甚至未分离的色谱峰。但目前基于GC-MS分析的线虫代谢组学样本前处理方法通用性不强，缺少对方法的优化，提取不够充分，难以实现高通量全范围的检测分析。在对药物筛选、毒理评价等研究时，对于性质或者含量差异较大的物质难以实现同步检测，提取的选择性较低，物质丰度低。因此，优化一种线虫样本前处理方法，将为科研人员研究以线虫为模型的代谢组学分析提供方便。

发明内容

本发明主要侧重于优化秀丽隐杆线虫基于GC-MS的代谢组学分析的样品前处理的提取方法通过对提取溶剂的选择优化，得到一种通用性强、提取充分、提取选择性高、重现性好的基于GC-MS代谢组学分析的秀丽隐杆线虫样品预处理方法。

本发明的第一个目的是提供一种秀丽隐杆线虫代谢组学分析的前处理方法，所述方法包括：(1)猝灭秀丽隐杆线虫得到线虫猝灭液；(2)线虫猝灭液中代谢物的提取，所述提取的提取液为乙腈、异丙醇和无菌水的混合溶液。

在本发明的一种实施例中，所述提取液中乙腈、异丙醇和无菌水的体积比为(1～3)：(1～3)：1。

在本发明的一种实施例中，所述猝灭液为甲醇和无菌水的混合溶液。