[发明专利]一株高产L-苏氨酸基因工程菌的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一株高产L‑苏氨酸基因工程菌的构建方法及其应用，属于基因工程和微生物发酵技术领域。本发明通过编码转录调控因子arcA基因的缺失、编码转录阻遏iclR基因的缺失，以及编码苏氨酸转运蛋白tdcC基因的缺失，较大幅度提高了L‑苏氨酸的产量。使发酵36h后L－苏氨酸产量提高至20.1g/L，转化率达到0.67。

技术领域

本发明涉及一株高产L-苏氨酸基因工程菌的构建方法及其应用，属于基因工程和微生物发酵技术领域。

背景技术

L-苏氨酸，分子式C₄H₉NO₃，相对分子量119.12，白色结晶或结晶粉末，是人体的必需氨基酸之一。苏氨酸为手性化合物，分别有L-苏氨酸、D-苏氨酸、L-别-苏氨酸和D-别-苏氨酸这四种异构体，其中具有生理活性和天然存在的只有L-苏氨酸。

在食品领域，L-苏氨酸作为食品强化剂被广泛应用，它可提高食品的营养价值，具有缓解疲劳，促进生长发育的效果。L-苏氨酸与其他氨基酸混合使用可起到抗氧化的作用，与葡萄糖一起加热后会产生焦香味。

在饲料领域，L-苏氨酸是重要的饲料用添加剂，是猪饲料配方中的第二大或第三大限制氨基酸，也是家禽饲料配方中的第三大或第四大限制氨基酸。在饲料中添加L-苏氨酸，不但可以平衡氨基酸组成，促进家禽生长，还可提高氮的利用率，降低饲养成本。

在医药领域，L-苏氨酸有促进人体生长发育，减轻人体疲劳和抗脂肪肝的功效，而且还是生产高效抗生素单酰胺菌素等的药物中间体，因此广泛应用于医药领域。L-苏氨酸可以促进淋巴细胞增殖，提高人体免疫功能；还可以保护细胞膜、促进脂肪酸氧化等。

虽然现在工业大生产L-苏氨酸产量已达120g/l，但其转化率(40％-50％)与理论转化率(81％)仍有较大差距。因此运用代谢工程的手段构建L-苏氨酸高产菌，减少成本，对L-苏氨酸的工业生产及国民经济等都具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株产L-苏氨酸基因工程菌，是以大肠杆菌为出发菌株，缺失了位于基因组上的arcA、iclR和tdcC基因。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌TWF001，已公开于2018年的论文《Increasing L-threonine production in Escherichia coli by engineeringthe glyoxylate shunt and the l-threonine biosynthesis pathway》中。

在本发明的一种实施方式中，所述arcA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述iclR的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述tdcC的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第二个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，所述方法是运用CRISPR基因编辑技术，敲除了大肠杆菌基因组上的arcA、iclR和tdcC基因。

本发明的第三个目的是提供一种提高大肠杆菌L-苏氨酸产量的方法，所述方法是将大肠杆菌位于基因组上的arcA、iclR、tdcC中的任一基因沉默或缺失。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是敲除arcA、iclR和tdcC基因。

本发明的第四个目的是提供一种生产L-苏氨酸的方法，所述方法以上述任一方法构建的基因工程菌为生产菌，在35～37℃发酵24～48h。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌先在37℃、200r/min培养4小时，再以初始OD₆₀₀为0.2转接到发酵培养基中，37℃、200r/min培养36小时。