[发明专利]针对河流弧菌的单域重链抗体Nb75

说明书

本发明提供了一种针对河流弧菌的单域重链抗体和多肽，其具有所示的氨基酸序列的蛋白质或多肽，可用于免疫检测、抗原富集纯化等领域。本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(亲和性、特异性、稳定性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。

技术领域

本发明涉及单域重链抗体技术(又称纳米抗体技术)，以及基因工程抗体技术，特别是针对河流弧菌的单域重链抗体或多肽。

技术背景

单域抗体是指由普通抗体可变区(VH或VL)组成的基因工程抗体。单域重链抗体(又称为纳米抗体，VHH抗体，variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)是指仅由重链抗体(heavy-chain antibody)可变区(Variable region)组成的基因工程抗体，其中，重链抗体(heavy-chain antibody)是一种存在于骆驼、鲨鱼等动物体内天然缺失轻链的抗体。单域重链抗体具有分子量小、渗透性好等特点，目前已广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域。

河流弧菌(Vibrio fluvialis，VF)是海洋中一种常见的条件致病菌，是弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌。它是一种革兰氏阴性兼性厌氧细菌，可引起人类河弧菌肠炎，临床症状与霍乱样腹泻极为相似。河弧菌于1975年首次分离于巴林一名腹泻患者粪便中，同年从孟加拉国的腹泻患者粪便中及英国的海产品和水产品中也分离得到。河流弧菌能够对免疫功能健全或艾滋病患者引起多种疾病，如菌血症、肠道感染和急性腹泻等，由这类病原菌引起的疾病还包括化脓性胆管炎、腹膜炎。古巴的一项研究表明河流弧菌是不同外肠道样品中主要病原菌之一。

目前，已有针对河流弧菌的单克隆抗体的公开报道，但现有的针对河流弧菌的单克隆抗体与单域重链抗体相比，存在生产成本相对较高，制备过程复杂等缺点。单域重链抗体具有分子量小、易表达等性质，显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供针对河流弧菌的单域重链抗体(包括含有所述单域重链抗体全部或部分功能区域的蛋白质或多肽)及其氨基酸序列，其可以被用于制备检测河流弧菌的试剂和工具。

本发明提供一种针对河流弧菌的单域重链抗体Nb75，该单域重链抗体具有如SEQID NO：8所示的氨基酸序列。

上述氨基酸序列通过标准化的氨基酸序列编号法进行IMGT编号和结构域的划分，如图1所示。

本发明所提供的单域重链抗体分别包括四个框架区(Framework region，FR)和三个互补决定区(Complementarity-determining region，CDR)。SEQ ID NO：8中，框架区(FR1-FR4)分别选自1～34，43～59，69～106，125～135氨基酸序列，互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自35～42，60～68和107～124氨基酸序列，其中，FR1序列如SEQ ID NO：1所示，FR2序列如SEQ ID NO：2所示，FR3序列如SEQ ID NO：3所示，FR4序列如SEQ ID NO：4所示，CDR1序列如SEQ ID NO：5所示，CDR2序列如SEQ ID NO：6所示，CDR3序列如SEQ ID NO：7所示(见序列表或图1)。互补决定区主要负责抗原的识别，框架区结构相对稳定，主要起着支撑维持蛋白质结构的作用。

本发明还涉及编码针对河流弧菌的单域重链抗体Nb75氨基酸序列的核苷酸，其序列如SEQ ID NO：9所示。

本发明还提供一种针对河流弧菌的单域重链抗体Nb75的制备方法，包括如下步骤：

(1)设计特异性引物，通过PCR技术从羊驼来源的cDNA文库中扩增；

(2)将得到的PCR产物的基因片段克隆到表达载体pET25b-CTB，并将该充足质粒转化宿主细胞，诱导表达针对河流弧菌的纳米抗体Nb75，并对其纯化。