[发明专利]高效表达谷氨酰胺转氨酶的突变体

说明书

本发明公开了一种高效表达谷氨酰胺转氨酶（TGase）的突变体，构建过程包括：以实验室保存的质粒pINA1297/N355Q为模板，以P1和P2为引物进行PCR得到含有吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）来源TGase酶原区（pro(S.H)）基因；以S. mobaraensis基因组为模板，扩增得到S. mobaraensis TGase基因；通过融合PCR将pro(S.H)与TGase基因连接，将其表达于食品级安全菌株——解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica po1h），得到了TGase的高产菌株。

技术领域

本发明涉及一种突变体，特别是涉及一种高效表达谷氨酰胺转氨酶的突变体。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase， EC 2.3.2.13， TGase），可以催化肽链中的谷氨酰胺残基中的γ-羧酰胺基与酰基受体发生转酰基反应，从而使蛋白质或多肽之间发生共价交联。TGase在食品加工领域的应用广泛，比如，TGase可使蛋白质与必须氨基酸（如赖氨酸）交联，提升一些食品的营养价值。TGase可以将碎肉粘结成块，提高肉制品的利用率，改善肉制品的弹性。此外，TGase在医药，化妆品，生物技术研究，纺织业及皮革加工等领域均有巨大的市场需求。

微生物来源的谷氨酰胺转氨酶通常以无活性酶原（pro-MTG）的形式分泌，需经蛋白酶dispase等切除N-端酶原区（pro）才能转化成活性MTG。酶原区（pro）位于信号肽与成熟酶之间，对谷氨酰胺转氨酶的折叠和分泌具有重要的影响。

微生物来源的谷氨酰胺转氨酶生产菌株主要是茂源链霉菌（Streptomyces mobaraensis），但野生菌的产量普遍低于重组菌，利用基因工程技术将谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等宿主中，使得MTG能够高效表达，但多数宿主为非食品安全菌株。此外，目前国内用于生产的菌株菌种遗传不稳定，生产上需要大量的人员开展复壮工作。因此，如何在食品安全菌株中稳定、高效的表达谷氨酰胺转氨酶，是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效表达谷氨酰胺转氨酶的突变体，其以S. mobaraensis来源的谷氨酰胺转氨酶基因及其酶原区（pro）为基础，通过将酶原区替换为吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）来源的酶原区（pro(S.H)），实现了谷氨酰胺转氨酶在食品级安全菌株——解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica po1h）中的高效表达，得到了谷氨酰胺转氨酶的高产菌株。

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种高效表达谷氨酰胺转氨酶的突变体，其特征在于，所述高效表达谷氨酰胺转氨酶的突变体以实验室保留的质粒pINA1297/N355Q为模板，P1和P2为引物进行PCR，通过PCR扩增含有pro(S.H)酶原区的1297表达载体。

优选地，所述PCR扩增采用以下体系：模板1 μL，上下游引物各1 μL，primeSTAR 25μL，双蒸水22 μL。

优选地，所述PCR扩增采用以下条件：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃5 min 30 s，72 ℃ 20 min，30个循环。

优选地，所述高效表达谷氨酰胺转氨酶的突变体采用比色法测定谷氨酰胺转氨酶的酶活。