[发明专利]巢式PCR特异性引物对、试剂盒及其制备方法和在辅助鉴定Ln基因编辑材料中的应用

说明书

本发明公开了一种基因编辑创制大豆窄叶型种质的方法及相关鉴定方法，包括向目的大豆中导入大豆基因组编辑的载体，在W82的基因组上对Ln(Glyma.20g25000)基因进行编辑，在Ln基因的编码区敲除了4个碱基，使Ln基因发生隐性突变为ln得到窄叶大豆，将其命名为ZH609；大豆基因组编辑的载体含有Cas蛋白基因、sgRNA编码基因。采用上述方法能够实现对大豆定点基因编辑，获得具有窄叶性状的大豆，具有较高育种价值。本发明还公开了一种巢式PCR特异性引物对和具有其的试剂盒及其制备方法和应用，利用特异性PCR引物扩增的方法，简便快捷地进行鉴定，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定Ln基因编辑材料和W82、ZP661等含Ln基因的常规品种，或检测Ln基因编辑材料后代纯杂合情况的目的。

技术领域

本发明涉及巢式PCR特异性引物对和具有其的试剂盒及其制备方法和在辅助鉴定Ln基因编辑材料中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

大豆是我国仅次于玉米、小麦和水稻的第四大作物，是我国主要的粮食和油料作物之一。由于大豆具有极高营养价值、高生理活性和广泛工业用途，世界对大豆的需求日益增加。大豆产业的发展对解决世界性植物蛋白短缺，改善食物结构，发展有机农业，减少能源消耗和环境污染，具有战略意义。过去一个多世纪，虽然全球大豆的产量保持持续增长的趋势，但仍然无法满足人类对大豆日益增长的需求，提高大豆产量潜力一直是大豆育种的重要任务。

大豆的产量是由单位面积株数、每株荚数、每荚粒数和粒重构成。以上四个产量构成因素中任何一个因素发生变化都会引起产量的增减。周新安等研究发现在一定范围内增加每荚粒数，是提高大豆单产的一条有效途径(周新安等，Relation of three-seed andfour-seed pods with yield of RIL in soybeans)。大豆是短日照植物，对反应较敏感，边际大豆植株透光性好，单株产量往往是内部植株的数倍之多[滕卫丽等，不同叶形大豆品种产量性状边际效应指数分析]。因此，大豆叶形的研究对改良大豆植株的空间结构分布、提高大豆产量具有非常重要的意义。

大豆中Ln位点是一个研究已久的经典叶形控制位点，Bernard和Weiss(1973)首次报道窄叶性状由一个质量基因控制，命名为ln。Takahashi(1934)首次报道窄叶叶形和每荚粒数的关系，指出窄叶大豆倾向于具有更多的4粒荚。Jeong等(2012)定位了ln位点，并指出ln具有一因多效的特性，是控制大豆叶形和每荚粒数的主效位点。

CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因编辑技术，则是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，该技术以RNA引导，通过RNA与靶序列间的碱基互补而完成识别过程，这一过程简单灵活，靶位点的选择仅需符合不同系统的PAM(protospacer-adjacent motif，PAM)要求即可。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguide RNA)，引导Cas9对DNA的定点切割。

发明内容

有鉴于此，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在W82的基因组上对Ln基因进行编辑，使Ln基因发生隐性突变为ln。将编辑后的材料进行田间种植和考种，经过表型观察和考种数据统计分析，得出编辑后的材料叶形变尖变窄(length/width＝2.3)，四粒荚数显著性增多，提供了巢式PCR特异性引物对和具有其的试剂盒及其制备方法和在辅助鉴定Ln基因编辑材料中的应用，作为鉴定Ln基因编辑位点和野生材料的标记，用以鉴定Ln基因编辑材料和W82、ZP661等含Ln基因的常规品种，或检测Ln基因编辑材料后代纯杂合情况。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：