[发明专利]一种分泌型靶向CD133的CAR-T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种分泌型靶向CD133的CAR‑T细胞，包括分泌PD‑1抗体且靶向CD133的CAR‑T细胞；分泌IL12细胞因子且靶向CD133的CAR‑T细胞。本发明还公开了此分泌PD‑1抗体或IL12的CAR‑T细胞的制备方法以及该CAR‑T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。本发明CAR‑T细胞分泌的PD‑1抗体，特异性的与T细胞表面的PD‑1相结合，阻断PD‑1/PD‑L1信号对T细胞活性的抑制反应，有利于CAR‑T长时间对肿瘤细胞生长产生有效的抑制；本发明CAR‑T细胞分泌的IL12细胞因子，可作用于肿瘤抑制性免疫微环境中的免疫抑制细胞，降低其免疫抑制能力，进而增强CAR‑T细胞的杀伤效果。

技术领域

本研究涉及医学生物领域，具体涉及一种靶向CD133且分泌PD-1抗体或IL12细胞因子的CAR-T细胞。此外，本发明还涉及该细胞的制备方法及应用。

背景技术

近年来，肿瘤免疫治疗的临床应用已经取得了显著进展，成为继手术、放疗、化疗和靶向治疗的另一种有效的肿瘤治疗手段。在多种肿瘤免疫治疗方法中，嵌合抗原受体(Chimeric Antigen receptor，CAR)修饰的T淋巴细胞(CAR-modified T lymphocyte，CAR-T)疗法被证实是一种针对恶性肿瘤极具前景的治疗手段。

大量的临床数据表明，针对CD19的CAR-T细胞对难治性或恶性B细胞淋巴瘤有很好的治疗效果，特别是对急性或慢性淋巴性白血病以及霍奇金淋巴瘤，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。目前针对CD19特异的CAR-T疗法——Kymriah and Yescarta，用于治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤，已在美国批准上市。

CAR-T是一种通过把患者自己的防御细胞(T细胞)取出来，人工(依靠基因技术)加上一种能够识别癌症细胞的部件(癌细胞识别抗原受体)，并大量复制，再给回患者，从而激发患者自身防御细胞的杀伤功能杀死癌症细胞。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，使得免疫细胞HLA具有非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。CAR分子的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原结合区(Single chain antibody Fragment，scFv)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号转导区。其中scFv段的设计对于CAR的特异性、有效性以及基因改造免疫细胞自身的安全性是关键的决定因素。

CD133是人类干/祖细胞膜上发现的一种跨膜糖蛋白，常表达于神经原始细胞、上皮/内皮祖细胞谱系、造血干/祖细胞等，是目前用来标记或分选干/祖细胞的最常用的膜表面标志。近年来，越来越多的研究表明，CD133已经成为众多肿瘤干细胞表面的特异性标记分子，在超过50％的肝细胞癌(HCC)中均检测到CD133的高表达。此外，在多种实体瘤中均有CD133的较高表达，包括神经胶质瘤、肝癌、肺癌，结肠癌、胰腺癌、乳腺癌及卵巢癌等。已有报道表明，在晚期肝癌患者中，检测到较高的CD133表达，且CD133的高表达也预示着较差的预后。此外，CD133作为肿瘤干细胞(CSCs)和内皮祖细胞的标志物，已被证实与肿瘤发生、转移、侵袭、耐药及复发等密切相关。因此，CD133的这些特性使其成为CD133表达阳性的晚期肿瘤患者免疫治疗的理想靶点。已报道的靶向CD133阳性细胞的方法包括抗CD133的免疫毒素、双特异性抗体等，均显示了一定应用前景。此外，靶向肿瘤干细胞靶点CD133的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞或NK细胞可以特异性杀伤病人的脑胶质瘤干细胞或卵巢癌干细胞。在一个晚期胆管癌患者中，CD133特异性的CAR-T细胞治疗使其获得了持续4.5个月的部分响应。

虽然CAR-T细胞免疫治疗在动物模型和患者身上表现了令人振奋的作用，但二代、三代CAR-T细胞在实体瘤治疗领域仍面临巨大挑战，主要包括：缺乏肿瘤特异性抗原，从而存在攻击正常细胞引起严重副反应的风险；T细胞难以有效的到达肿瘤部位，CAR-T细胞浸润实体瘤的能力不足、存活时间短，以及一系列的免疫抑制分子及免疫抑制肿瘤微环境等均会限制CAR-T细胞的抗肿瘤疗效，如T细胞膜蛋白3(TIM-3)、淋巴细胞激活因子3(LAG-3)、细胞毒性T淋巴细胞-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)及其两个主要配体PD-L1、PD-L2等。