[发明专利]玉米Zm-Prx5基因分子标记、获得方法及在茎腐病防治中的应用

权利要求书

1.一种能够鉴定玉米茎腐病的分子标记，其特征在于，所述分子标记为如SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.6所示的Zm-Prx5基因。

2.一种权利要求1所述的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，提取玉米的总RNA备用；

步骤2，将玉米总RNA反转录成cDNA第一链；

步骤3，分子标记的克隆

合成引物：Zm-Prx5F1:5'-AAAACCGGTTGCTATTAGTAC-3'；Zm-Prx5 R1:5'-GAAGAAAACAAAATGTCTGC-3'；

用步骤2反转录的cDNA第一链作为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：10×PCRBuffer 4μl、dNTP 1μl、Zm-Prx5 F1 0.5μl、Zm-Prx5 R1 0.5μl、cDNA模板1.5μl、Taq酶0.5μl、灭菌H₂O 17μl；

PCR结束后琼脂糖凝胶电泳，回收743bp的条带，即获得能够鉴定玉米茎腐病的分子标记。

3.根据权利要求2所述的能够鉴定玉米茎腐病的分子标记的获得方法，其特征在于，将回收743bp的条带转化入大肠杆菌感受态细胞中，保存备用。

4.根据权利要求1所述的分子标记在玉米茎腐病防治中的应用。

5.根据权利要求4所述的分子标记在玉米茎腐病防治中的应用，其特征在于，利用所述分子标记Zm-Prx5基因构建能够稳定表达Zm-Prx5的过表达载体，然后将所述过表达载体转化入农杆菌感受态细胞中，得到转化菌，最后用所述转化菌转化玉米植株，获得具有玉米茎腐病抗性的阳性转基因株系。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的Zm-Prx5的过表达载体按照以下步骤构建：

合成引物，如下：Zm-Prx5 R7：5'-ACCCATGGATGGCTCCCATCGCT-3'；Zm-Prx5F7：5'-ACAGATCTCTAAAGCGCCTTCAG-3'，；

以权利要求3含有Zm-Prx5基因的大肠杆菌感受态细胞为模板进行PCR扩增，PCR结束后，琼脂糖凝胶检测，回收目的DNA条带，并将回收的目的DNA条带与T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒PMD-Zm-Prx5；

将重组质粒PMD-Zm-Prx5和质粒载体pCAMBIA 3301分别用NcoI和BglⅡ双酶切，分别回收PMD-Zm-Prx5目的片段和线性的质粒载体pCAMBIA 3301目的片段；两个双酶切产物经T4T4-DNA连接，构建成Zm-Prx5过表达载体，命名为pCAMBIA 3301-Zm-Prx5保存备用；

用pCAMBIA 3301-Zm-Prx5转化S1的农杆菌感受态细胞，得到转化菌；

将转化菌导入到玉米幼胚培养的愈伤组织，后续进行筛选和诱导再生，获得T0代转基因材料。

7.根据权利要6所述的应用，其特征在于，种植T0代转基因材料，在玉米5叶时，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的阳性植株，阳性植株自交获得T0代种子；种植获得的T0代转基因玉米株系，在玉米5叶时，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T0代阳性植株，T0代阳性植株自交得到T1代种子；筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T1代阳性植株，T1代阳性植株自交得到T2代种子，种植T2代种子，筛选出抗除草剂和具有Bar基因的T2代阳性植株，T2代阳性植株为稳定性高的抗玉米茎腐病植株。

8.根据权利要6所述的应用，其特征在于，阳性克隆子的PCR反应体系如下：模板1μl、2×GC buffer I 12.5μl、dNTP 2.0μl、Zm-Prx5 F2 1.0μl、Zm-Prx5 R2 1.0μl、LA-Taq 0.3μl、ddH₂O 7.2μl；总体积25μl；

PCR反应程序如下：95℃预变性5min；95℃变性1min，62℃退火1min，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸10min；4℃forever。