[发明专利]一种温敏性聚合物L64-IDA-Cu(II)及分离纯化菠萝蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)，所述聚合物由三嵌段聚合物L64、亚氨基二乙酸、铜离子鳌合合成。

2.一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，所述方法如下：

（1）三嵌段聚合物L64的环氧化：

称量一定量的L64和环氧氯丙烷加入圆底烧瓶，慢慢滴加三氟化硼乙醚络合物（含质量分数为50%的三氟化硼BF₃）并于冰水浴搅拌过夜；维持搅拌，滴加NaOH，并再次于冰水浴下搅拌数小时；

（2） L64与亚氨基二乙酸（IDA）的偶联：

称量一定量环氧化的L64，加入NaOH调节pH后，加入IDA，搅拌条件下水浴；再加入Na₂SO₄，反应物成两相，用分液漏斗收集上相的富L64相，加热再次分成两相；收集下相中L64，用水稀释，并再次分相收集下相，得到偶联IDA的L64；

（3）偶联IDA的L64螯合Cu(II)，得到聚合物：

L64-IDA中加入CuSO₄溶解于一定量的醋酸钠缓冲溶液中，室温下搅拌；之后将溶液用氯仿萃取，氯仿相合并，蒸发溶剂；产物用水稀释，温度诱导分相，得终产物。

3.根据权利要求2所述的一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述L64和环氧氯丙烷的质量比为15-25：0.5-0.9；所述三氟化硼乙醚络合物（含质量分数为50%BF₃）用量为0.75-1.25mL；所述滴加的NaOH的量为3-5mL，质量分数为40%。

4.根据权利要求2所述的一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述环氧化的L64、IDA和Na₂SO₄的用量以质量比计为15-25：1.0-1.7：7.5-12.5。

5.根据权利要求2所述的一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述调节pH为7-12.5；所述搅拌条件下水浴为48℃下搅拌水浴20h；所述分相条件为在65℃条件下分相。

6.根据权利要求2所述的一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述L64-IDA、CuSO₄和醋酸钠缓冲溶液的用量为7.5-12.5g：2.25-3.75g：37.5-62.5mL；其中醋酸钠缓冲溶液为浓度为50mM、pH值为4.0。

7.根据权利要求2所述的一种温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述室温下搅拌10h；所述分相条件为65℃条件下分相。

8.一种循环高效分离纯化菠萝蛋白酶的方法，其特征在于，以权利要求1中所述的温敏性能螯合金属铜离子的聚合物L64-IDA-Cu(II)为捕集剂，具体步骤如下：

（1）双水相浮选分离菠萝蛋白酶：

将含有磷酸氢二钾和菠萝蛋白酶的溶液中加入所述的L64-IDA-Cu(II)作为捕集剂混合作为下相，上相为溴化1-丁基-3-甲基咪唑，浮选，分别收集浮选到含L64-IDA-Cu(II)-菠萝蛋白酶复合物的上相和下相的盐溶液，测定浮选后上相和下相中的酶活和蛋白含量；

（2）结合沉淀法纯化菠萝蛋白酶：

将步骤（1）中收集到的上相混合溶液加入硫酸铵作为分相盐，加热分相，此时的上相为溴化1-丁基-3-甲基咪唑溶液，下相为L64-IDA-Cu(II)-菠萝蛋白酶的复合物溶液；在下相中加入咪唑进行洗脱，加热分相，此时上相为含菠萝蛋白酶的水溶液，而下相为含L64-IDA-Cu(II)-咪唑复合物的溶液。