[发明专利]检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒及应用

权利要求书

1.一种检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒，其特征在于该试剂盒装有FITC标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体1支；

所述的FITC标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体是用以下方法制备：

(1) 通过肌肉注射17β-雌二醇诱导褐牙鲆肝脏大量转录Chg H mRNA，用Trizol提取肝脏总RNA，经反转录获得cDNA，以反转后的cDNA为模版，利用引物F:CACCCAAGTTTTCAAGTCTCAGCAGTC，R:CCGCTTACTGAGCAGGGTCAATGAAT进行PCR扩增，回收目的片段；用T4连接酶将目的片段与pClone007载体连接后，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，并进行测序，将测序正确的进行扩大培养，抽提质粒，以上述引物进行PCR扩增，切胶回收目的片段；

将回收的目的片段与pDE1表达载体连接后，将连接产物转化至表达宿主菌BL21(DE3)；并将正确表达的宿主菌扩大培养，即加入终浓度为0.1 mM的IPTG，置于37℃恒温摇床里震荡培养10小时，将培养好的菌液5000 rpm 离心20 min，收集沉淀，经裂解液处理后，再次离心收集包涵体，向包涵体中加入30 mL溶解液，4℃搅拌过夜，所述溶解液为100 mM Tris，500 mM NaCl，10 mM咪唑，8 M尿素，pH8.0；将溶解后的包涵体10000 rpm 离心30 min，收集上清并过0.45 μm滤膜，采用镍离子螯合磁珠纯化，即获得褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品；

(2) 利用得到的褐牙鲆卵壳前体蛋白纯品免疫小鼠：将70 µg的卵壳前体蛋白纯品和等体积的弗式完全佐剂乳化后注射入小鼠腹腔，两周后用同样剂量的卵壳前体蛋白纯品与弗氏不完全佐剂充分乳化后对Balb/c小鼠进行加强免疫，一周后尾静脉注射卵壳前体蛋白纯品进行加强免疫，三天后取小鼠的血清，利用Protein G亲和层析柱从腹水上清中纯化获得免疫球蛋白IgG；纯化的抗体经PBS缓冲液透析24 h，即获得褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体；

(3) 将浓度为1 mg/mL纯化的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体置于交联反应液中4℃透析过夜，所述交联反应液为7.56g NaHCO₃，1.06g Na₂CO₃，7.36g NaCl，1 L ddH₂O；按抗体：FITC=6：1的比例，称取FITC，缓慢加入抗体溶液中以将FITC标记至抗体；边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应8 h；用半饱和的硫酸铵将标记后的抗体沉淀分离，以除去未结合的荧光素，将交联物在PBS中透析至透析液清亮，即获得FITC标记的褐牙鲆卵壳前体蛋白多克隆抗体。

2.权利要求1所述的检测褐牙鲆卵壳前体蛋白的免疫荧光试剂盒在海洋环境雌激素类物质检测中的应用。