[发明专利]一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法

说明书

本发明公开了一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法。所述方法利用一种敲除ACADSB基因的gRNA的识别序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明利用发明人设计的gRNA，精确且高效的敲除ACADSB基因，有效的构建了一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞，本发明解决了RNAi技术存在干扰效率低的缺陷，提供了一种简便高效的构建基因敲除细胞系的方法。ACADSB基因作为与脂代谢、脂肪酸代谢相关的重要标志基因，其敲除细胞系的建立，也进一步为脂代谢及脂肪酸代谢通路相关基因功能的研究，提供了有效的基因素材与基因工具。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法。

背景技术

CRISPR-Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代基因编辑技术，该技术来源于细菌和古细菌中存在抵抗噬菌体入侵的CRISPR-Cas获得性免疫系统，后经人工改造而逐渐发展起来。CRISPR-Cas基因组编辑技术主要是通过一段RNA来识别打靶位点，通过Cas 9核酸内切酶对打靶位点附近的核酸进行切割来实现对基因的定点编辑，大大的提高了基因编辑的效率，实现了对多种细胞模型和动物模型进行基因修饰的作用。

奶牛的乳腺组织具有合成和分泌乳汁的生理功能，可以作为大多数生物学研究的生物反应器。而在体外培养的乳腺上皮细胞可以保持这个合成和分泌乳汁的能力，并可以作为细胞的试验模型来研究乳汁中乳脂、乳蛋白等成分的基因表达情况。因此，体外培养的奶牛乳腺上皮细胞具有其重要的应用价值，并可作为一种基因素材应用于与乳脂代谢相关候选基因的验证研究中，也为基因功能的研究奠定基础。

ACADSB基因是短支链酰基辅酶A脱氢酶(acyl-coA dehydrogenase,short/branched chain，ACADSB)，是线粒体酶短支链酰基辅酶A(acyl-coAdehydrogenases,ACADs)家族的一员。它能促进酰基辅酶A衍生物在脂肪酸代谢过程和支链的氨基酸代谢过程中的脱氢作用。即ACADSB基因可直接参与脂肪酸氧化或脂肪酸降解的代谢通路。脂代谢过程中，脂肪经脂肪酶氧化分解为甘油三酯和游离脂肪酸，进一步再分解成为乙酰辅酶A参与三羧酸循环(TCA)，参与葡萄糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢，最终生成水和CO₂。而且，ACADSB基因本身就作为线粒体内ACADs家族的成员之一，对于线粒体内的一种关键酶来说，基因一旦发生突变或者是缺失，会直接对线粒体的能量代谢产生影响，作用机体的有氧呼吸和糖酵解。而ACADSB也作为与脂代谢及脂肪酸代谢通路中的关键功能基因，深入探讨和研究该基因的功能成为遗传工作者研究的热点。

但是，目前尚无利用奶牛乳腺上皮细胞系建立的ACADSB基因敲除模型。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种利用奶牛乳腺上皮细胞系建立的ACADSB基因敲除模型，有效的克服了siRNA干扰不能稳定遗传的技术缺陷。即对于RNAi技术，通过瞬时转染干扰载体质粒，在一定水平上能够抑制基因的表达，但细胞的转染效果也受多种因素影响，如细胞状态、细胞活性、细胞代数等，所以其干扰效果并不稳定。而对于稳定表达，构建常见的慢病毒载体，其包装量小于4k，对于大于4k的基因，包装效果并不好。而对于腺病毒载体，其包装的周期很长，对于一些较难感染的细胞，滴度太低，很难感染。而本发明的目的在于克服缺陷，为后续的研究奠定基础。

本发明的第一个目的是提供一种敲除ACADSB基因的sgRNA的识别序列。

本发明的第二个目的是提供所述的sgRNA的识别序列在敲除ACADSB基因中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述识别序列的gRNA引物对。

本发明的第四个目的是提供所述的gRNA引物对在敲除ACADSB基因中的应用。