[发明专利]用于检测罕见序列变体的组合物和方法

说明书

在一些方面，本发明提供了用于鉴定核酸样品中的序列变体的方法。在一些实施方案中，方法包括鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异，以及将存在于至少两个不同的环状多核苷酸，如两个具有不同接点的环状多核苷酸中的序列差异判定为序列变体。在一些方面，本发明提供了可用于所述方法中的组合物和系统。

本申请是2014年12月11日提交的发明名称为“用于检测罕见序列变体的组合物和方法”的第201410765164.3号中国专利申请的分案申请。

交叉引用

本申请要求在2013年12月11日提交的美国临时申请61/914,907、在2014年5月1日提交的美国临时申请61/987,414和在2014年6月11日提交的美国临时申请62/010,975的权益；上述所有美国临时申请均通过引用并入本文。

背景技术

鉴定复杂群体内的序列变异是一个活跃发展的领域，特别是随着大规模平行核酸测序的出现。然而，由于常用技术的固有误差频率比群体内许多实际序列变异的频率更大，大规模平行测序具有显著的局限性。例如，0.1-1％的误差率已在标准的高通量测序中被报道。当变体频率低，如等于或低于误差率时，对罕见序列变体的检测具有高的假阳性率。

检测罕见序列变体的原因有很多。例如，检测罕见特征性序列可用于鉴定和区分有害环境污染物如细菌分类群的存在。表征细菌分类群的常见方式是鉴定高度保守序列如rRNA序列的差异。然而，针对此的典型的基于测序的方法面临与给定样品中如此多数量的不同基因组和成员之间的同源性程度相关的挑战，从而为本已繁琐的程序呈现出复杂的问题。改进的程序将具有加强在多种设置下的污染检测的潜力。例如，用于组装卫星和其他空间飞行器的部件的洁净室可使用本系统和方法进行勘测，以了解存在何种微生物群落，并且开发更好的去污染和清洁技术，从而防止将地球微生物引入其他星球或其样品，或开发用来将由推定的地球外微生物产生的数据与由污染性地球微生物产生的数据进行区分的方法。食品监测应用包括对食品加工厂生产线的定期检测，调查屠宰场，检查餐厅、医院、学校、监狱和其他机构的厨房和食品储存区的食源性病原体。也可以类似地监测水源储备和加工厂。

发明内容

鉴于以上所述，对改进的检测罕见序列变体的方法存在需求。本发明的组合物和方法满足了该需求，并且还提供了另外的益处。特别是，本发明的各个方面提供了对罕见或低频核酸序列变体(有时称为突变)的高度灵敏的检测。这包括对在正常序列背景中可能含有少量变异序列的样品中的低频核酸变异(包括取代、插入和缺失)的鉴定和阐明，以及对在测序错误背景下的低频变异的鉴定。

在一个方面，本发明提供了一种鉴定序列变体，例如核酸样品中的序列变体的方法。在一些实施方案中，多个多核苷酸中的每个多核苷酸具有5’末端和3’末端，并且该方法包括：(a)将所述多个多核苷酸中的单独多核苷酸进行环化以形成多个环状多核苷酸，其中每个环状多核苷酸在5’末端与3’末端之间具有接点(junction)；(b)扩增(a)的环状多核苷酸；(c)对扩增的多核苷酸进行测序以生成多个测序读取；(d)鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异；和(e)将存在于至少两个具有不同接点的环状多核苷酸中的序列差异判定(calling)为序列变体。在一些实施方案中，该方法包括鉴定测序读取与参考序列之间的序列差异，以及将存在于至少两个具有不同接点的环状多核苷酸中的序列差异判定为序列变体，其中：(a)该测序读取对应于该至少两个环状多核苷酸的扩增产物；且(b)该至少两个环状多核苷酸中的每一个包含通过连接相应多核苷酸的5’末端和3’末端而形成的不同的接点。