[发明专利]提升马铃薯PSTVd抗性的amiRNA及其应用

说明书

本发明公开了提升马铃薯PSTVd抗性的amiRNA及其应用，amiRNA的核酸序列如SEQ ID NO.4所示，利用表达小RNA的策略，表达人工miRNA，获得具有较好的抗PSTVd效果的转基因马铃薯，且与野生型马铃薯在生物学表型上没有明显的差异，该方法不需要长的病源cDNA片段，有效的小RNA不会被大量由长cDNA片段产生的无效的小RNA所稀释，没有同源性的人工miRNA序列可以避免“脱靶”，不会造成植物发育缺陷；还可以可以避免长片段RNA同源互补对农业生产应用中带来的生物安全问题；并且也可以为其他作物的转基因抗病育种工作提供一些理论借鉴，促进我国作物分子抗病育种研究的发展。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及提升马铃薯PSTVd抗性的amiRNA，还涉及提升马铃薯PSTVd抗性的amiRNA的应用。

背景技术

马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)是影响马铃薯种薯质量的重要病害。该病害能够随着种薯的无性繁殖逐代传播，而且随着带毒代数的增加，症状越来越重，产量急剧降低，块茎变小，龟裂、畸形，基本失去商品性，更无种用价值。

国内外解决马铃薯种薯退化的主要方式是通过茎尖剥离、组织培养方式进行汰除病毒，建立脱毒种薯繁育体系，生产健康种薯。但存在以下问题，在众多的病原菌中，马铃薯纺锤块茎类病毒病不同于病毒，是没有蛋白外壳的裸露的亚病毒，是不能通过茎尖剥离、组织培养来汰除，一旦发现就只能淘汰，无法实现脱毒。

PSTVd可进入细胞核是由于类病毒序列或结构区域与细胞内运输因子相互作用，形成核酸-蛋白复合物，这个复合物将协助类病毒进入细胞核内。有研究表明，植物的转录因子类病毒结合蛋白1(VIRP 1)能被类病毒利用，协助类病毒在植物体内的复制和系统传播。这个类病毒结合蛋白是从RNA配体筛选过程中分离出来的，这个蛋白与正链PSTVd RNA相互作用，它是与染色体修复相关的转录调节因子家族中的一员。Virp 1含有核定位信号，可以进出细胞核，是PSTVd(和其它相关类病毒)进出细胞核的载体；在马铃薯中找到了与VIRP1蛋白同源的马铃薯基因brp基因。

随着现代分子生物技术的发展，分子育种技术逐渐应用在植物抗病毒方面，自l983年世界上诞生了第l例转基因植物以来(Deblock et al，1984)，植物基因工程技术已取得了突飞猛进的发展，为病毒病的防治和抗病育种工作开辟了新的途径，许多具有重要经济价值的转基因作物已经开始陆续进入实际应用阶段。目前植物抗病毒基因工程的策略主要包括3个：第一个策略是利用病毒本身的基因导入受体植物以获得抗性植株，所获得的抗性也称病原起源的抗性；第二、三个策略是分别利用植物中自然存在的抗性基因和植物、微生物的核糖体失活蛋白(RIPs)基因以及多基因策略获得抗病毒植物(Kalantidis etal，2008)。