[发明专利]一种扩张蛋白及其在几丁质胶体制备中的应用

说明书

本发明公开了一种扩张蛋白及其在几丁质胶体制备中的应用。本发明提供一种扩张蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该扩张蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。使用本发明扩张蛋白降解几丁质而制备出几丁质胶体，并且将几丁质制备成壳寡糖。采用本发明的方法，克服了传统化学法处理几丁质时产生大量的无机强酸废液，造成严重的环境污染、对设备要求高、产品质量差等现有技术中的不足。节约了成本，不造成环境污染，符合环境友好型。

技术领域

本发明属于功能基因克隆表达技术领域，具体涉及一种扩张蛋白及其在几丁质胶体制备中的应用方法。

背景技术

几丁质又称甲壳素是天然的多聚物，由基本结构单元N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1,4-糖苷键连接构成，广泛存在于甲壳类动物的外壳和真菌的细胞壁中。未经过任何处理的甲壳素具有致密的结构，其不溶于水、稀酸、碱及其他有机溶剂。只可通过强酸破坏甲壳素的晶体结构，将几丁质制备成几丁质胶体，然后用水解酶将几丁质胶体水解为N-乙酰葡萄糖胺或壳寡糖。产物壳寡糖具备抗肿瘤、降血压、增强免疫力等独特的药理功能活性；具有抑制植物病原菌的生长，诱导高等植物体内产生相关抗体等功能，在医药、食品保健品、种植等领域有了更大的应用价值。这使得制备几丁质胶体就成为一个重要关键步骤。

目前制备几丁质胶体的主要方法是，用高浓度的无机强酸溶解粉末几丁质，再中和强酸或大量水稀释，析出沉淀，离心出沉淀，将沉淀再次溶解成胶体。此方法在生产过程中浪费大量的水资源，并产生大量的无机强酸废液，造成严重的环境污染。因此，寻找一种绿色、高效高产高品质几丁寡糖的方法越来越受重视。

扩张蛋白来自于细菌和植物，是一种非水解性的辅助蛋白，对具有多糖网状结构的底物具有破坏作用，在不水解它们的过程中断裂多糖之间的氢键，打开多糖底物的致密晶体结构。从而可以使水分子或水解酶进入多糖底物，使其形成水溶性形态。

发明内容

本发明目的在于提供一种扩张蛋白及其在几丁质胶体制备中的应用制作方法；旨在克服了传统化学法水解几丁质胶体中化学试剂污染环境、产品质量差等现有技术中的不足，提供了一种经济高效、环保型酶法制备几丁质胶体的应用。

本发明解决技术问题采用的技术方案为：

本发明所提供的扩张蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

用于编码本发明的扩张蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO.1；本发明还提供一种含有扩张蛋白的重组表达菌，；

本发明的扩张蛋白用于制备几丁质胶体；

本发明提供一种制备几丁质胶体的方法，用本发明的扩张蛋白将几丁质制备成几丁质胶体，最适反应pH和温度分别为pH6.0、40℃；

本发明提供一种通过上述方法制备的几丁质胶体在几丁质酶作用下制备壳寡糖的方法，相较于未处理的几丁质，处理后的几丁质更易于水解，产生壳寡糖量更高。

本发明按真菌RNA提取试剂盒提取RNA，将提取的RNA按照RT-PCR试剂盒合成cDNA，根据目的基因的核苷酸序列设计引物，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，得到扩张蛋白基因，其编码区长528bp。

有益效果：

相较于已报道的几丁质胶体的制备方法，可通过生物法高效的水解几丁质中的氢键，破坏几丁质致密的网格结构来制备几丁质胶体。

附图说明:

图1：本发明的扩张蛋白基因的电泳检测图(M：蛋白Marker；22：扩张蛋白EX22基因)；

图2：EX22基因同源进化树图；

图3：EX22基因保守结构域分析图；

图4：重组质粒pPICZαA-EX22序列对比图；