[发明专利]一种大规模分离、纯化制备唾液酸糖肽（SGP）的方法

说明书

本发明公开了一种大规模分离、纯化制备唾液酸糖肽(SGP)的方法，包括：(1)取新鲜未受精的鸡蛋黄，经过苯酚处理，离心取上清浓缩后，冻干得唾液酸糖肽粗品；(2)取医用脱脂棉装填成棉花亲水色谱柱；(3)将唾液酸糖肽粗品的溶液加到棉花亲水色谱柱上；(4)将棉花亲水色谱柱用乙腈梯度洗脱除盐和杂质，用水将糖肽洗脱冻干得到唾液酸糖肽的纯品。本发明方法省略了以往方法中Sephadex G‑50分离，Sephadex G‑25除盐、离子交换色谱纯化等繁琐步骤，反应条件温和，降低了实验成本、缩短了纯化周期、提高了效率，纯度检测制备的唾液酸糖肽纯度达95％以上。本发明不仅适用于实验室糖肽的富集，还可用于工业生产。

技术领域

本发明涉及一种糖肽化合物的分离纯化方法，着重阐述了唾液酸糖肽的分离纯化，属于生物化学技术领域。

背景技术

唾液酸糖肽(Sialylglycopeptides,SGP)是一种从新鲜鸡蛋黄中提取到的具有天然复杂型N糖链的糖肽，由十一个单糖与六个氨基酸组成，其非还原末端通常为两个唾液酸，又称为双唾液酸糖肽(其结构如下所示)。

SGP有许多重要的生物活性，如可以作为拮抗剂抑制细菌及病毒与宿主细胞的结合，在抗菌方面可以抑制沙门菌等细菌与人类肠道细胞与小鼠组织细胞的结合。SGP中唾液酸化的α-(2→6)N-乙酰氨基乳糖残基还可以作为配体与A型人流感病毒血凝素结合，由此抑制流感病毒与宿主细胞的结合。因此，SGP有着成为良好抗菌、抗病毒预防类药物的潜力。更为重要的是由于糖链合成的困难，SGP中的糖链可以作为糖基供体，用于合成带有N-糖链的亲脂类化合物、糖簇的合成，还可以将该糖链连接到带有GlcNAc的糖蛋白或糖肽上，合成新的糖蛋白和糖肽。随着唾液酸糖肽在糖蛋白合成和修饰等领域的广泛应用，该糖肽的制备和生产引起了糖生物学领域的关注。

目前，制备SGP的方法主要有2种。第一种是1997年日本AkiraSeko[1]首次报道的从鸡蛋黄中分离纯化唾液酸糖肽的方法，也是目前主要的SGP制备方法。该方法对蛋黄进行苯酚处理后，经过两次Sephadex G-50分离，经Sephadex G-25除盐、再经DEAE-Toyopeael650M离子交换柱纯化，最后Sephadex G-25除盐后冻干得到样品,后期该实验室在纯化方面做出了进一步改进提出用高效液相色谱(HPLC)对SGP进行纯化，但用上述方法纯化SGP时，具有步骤多，成本高，周期长，样品损失较大，上样量少等缺点。第二种方法是Yang Zou[2]报道的。他们先用苯酚处理新鲜的鸡蛋卵黄，去除蛋白，再用Sephadex G-50进行分离，最后用活性炭柱进行纯化和脱盐，该方法虽然简化了一些步骤，但周期相对本发明方法仍然较长，柱填料成本较高。

因此开发一种成本低廉、周期短、步骤少、效率高的SGP大规模分离纯化方法显得尤为迫切和必要。

[1]Seko A,Koketsu M,Nishizono M,et al.Occurrence of asialylglycopeptide and free sialylglycans in hen's egg yolk[J].BiochimBiophys Acta,1997,1335:23-32.

[2]Zou Y,Wu Z,Chen L.An efficient approach for large-scaleproductionof sialyglycopeptides from egg yolks[J].J Carbohydr Chem,2012,31:436-446.

发明内容

针对现有唾液酸糖肽分离技术中存在的步骤多、周期长、成本高等缺点，本发明的目的是提供一种周期短、成本低、效率高的分离、纯化制备唾液酸糖肽(SGP)的方法。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

该方法包括以下步骤：