[发明专利]冠状病毒抗性克隆猪及其制备方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取特异性靶向pAPN基因第2外显子和第3外显子的gRNA序列，其核苷酸序列依次如SEQ ID No.1-2所示；

制备获得对应gRNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体，所述CRISPR/Cas9打靶载体的制备方法为：将PX330载体用限制性内切酶BbsI进行酶切；分别合成第2外显子和第3外显子的gRNA正链和互补链DNA，并在两端带上与酶切后的PX330载体形成的黏性末端相匹配的序列；将第2外显子和第3外显子的gRNA正链与其互补链DNA分别混合，然后将混合后的混合序列置于温度至少为98-100℃的水中煮沸2.5-3.5min，然后静置冷却至20-30℃，使得两条互补链DNA退火形成双链DNA，并携带可与由BbsI酶切后的PX330载体相连接的黏性末端；退火形成的双链DNA与由BbsI酶切后的PX330载体连接；获得打靶载体PX330-pAPN2和打靶载体PX330-pAPN3；

(2)将获得的打靶载体PX330-pAPN2或打靶载体PX330-pAPN3转入猪胎儿成纤维细胞中，经单克隆化及筛选获得双等位pAPN敲除的阳性克隆；

(3)以阳性细胞为核供体，植入去核猪卵母细胞中，获得阳性重构猪胚胎；再将重构猪胚胎植入代孕母猪子宫内妊娠，获得所述克隆猪。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，打靶识别位点SEQ ID No.1和SEQ ID No.2位于基因编码区的ATG下游的最开始的1-2个外显子上。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，选用CRISPR骨架载体PX330，并将基因编辑位点序列构入骨架载体获得pAPN特异的CRISPR打靶载体PX330-pAPN2和PX330-pAPN3。

4.根据权利要求3所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，将CRISPR打靶载体PX330-pAPN2和PX330-pAPN3转染入猪胎儿成纤维细胞中，通过低密度培养，在不需要抗生素筛选的情况下获得纯的单细胞克隆。

5.根据权利要求4所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，对筛选的单细胞克隆，采用PCR扩增和测序，并以测序峰图分析方法鉴定出具有不同基因型的细胞克隆，采用的扩增和测序引物包括gRNA2打靶位点分析引物和gRNA3打靶位点分析引物，所述gRNA2打靶位点分析引物的核苷酸序列依次如SEQ ID No.5-6所示；所述gRNA3打靶位点分析引物的核苷酸序列依次如SEQ ID No.7-8所示。

6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，体细胞的pAPN采用的编辑方式是利用CRISPR在其外显子2或3上引入双等位移码突变，从而两个等位pAPN基因的表达完全缺失。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，结合体细胞基因编辑和体细胞核移植制备基因编辑猪。

8.根据权利要求7所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法，其特征在于，对猪卵母细胞去核，将pAPN基因编辑的体细胞与去核卵母细胞融合产生pAPN基因编辑的重构猪胚胎，将重构胚胎植入代孕母猪子宫，通过妊娠出生与供体细胞基因型一致的克隆猪。

9.一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪，其特征在于，采用权利要求1-8任意一项所述的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的冠状病毒抗性克隆猪的制备方法获得。