[发明专利]一种蛋白的电荷异质性检测方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白的电荷异质性检测方法，即将蛋白进行酶切、片段分离、变性还原和去糖基化修饰等特殊的蛋白前处理后，采用cIEF、iCIEF等等电聚焦电泳进行检测，得到的电荷异构体的分离效果好，能够对蛋白的电荷异质性进行定性及定量分析，尤其适用于对具有复杂电荷异质性的蛋白进行电荷异质性检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白的电荷异质性检测方法。

背景技术

蛋白类药物是一类通过细胞表达的生物技术药物，包括单克隆抗体、重组蛋白、融合蛋白等，这类药物被用于癌症、自身免疫性疾病及其他疾病的治疗。这类药物中的蛋白常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体。其中，由于蛋白分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关，可能来自于蛋白分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺等。

蛋白的电荷异质性可能对蛋白类药物的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学具有重要影响，是蛋白类药物的关键质量属性(CQA)。例如，基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、药代等方面的影响做过一个总结，结果表明：①当电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学；②增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除；③降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除。此外，蛋白的电荷异质性还可反映蛋白药物生产工艺的稳定性。综上，蛋白的电荷异质性检测在蛋白药物的质量控制中十分重要。

为了实现蛋白的电荷异质性检测，人们通常将蛋白直接或进行简单脱盐处理后，与载体两性电解质、pI Marker等溶液混合，通过等电聚焦电泳(IEF)、毛细管等电聚焦电泳(cIEF)和全柱成像毛细管等电聚焦电泳(iCIEF)等方法进行检测。但常规的检测方法通常只能实现蛋白电荷异质性的定性分析，不能满足其定量分析要求。对于具有电荷异质性较为复杂的蛋白，常规的检测方法不能满足蛋白电荷异质性的定性和/或定量分析要求。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种蛋白的电荷异质性检测方法，用于蛋白的电荷异质性的定性及定量检测。本发明提供如下技术方案：

一种蛋白的电荷异质性检测方法，包括以下步骤：

采用蛋白酶对待测蛋白进行酶切，分离酶切片段，对分离后的酶切片段进行变性还原和去糖基化修饰处理后，采用等电聚集电泳进行电荷异质性检测；优选地，所述蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明所述蛋白的电荷异质性检测方法中，所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、IdeZ蛋白酶或重组化脓性链球菌IgG降解酶，优选为重组化脓性链球菌IgG降解酶。

本发明所述的分离酶切片段为采用亲和树脂分离方法进行，所述亲和树脂为常规的蛋白A树脂、蛋白G树脂，具体如本发明中例举的GE Healthcare的MabSelect^TM树脂。本发明所述的分离酶切片段也可以采用其他常用的蛋白分离方法进行，例如利用不同酶切片段的分子量大小差异、分子结构差异、溶解度差异、对某些配体(如蛋白A，蛋白G)的亲和力差异等进行分离，只要能够将酶切片段有效分离即可。

本发明所述“变性还原”处理指通过加入变性剂(如盐酸胍、尿素、表面活性剂等)和还原剂(如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等)，使蛋白质中的二硫键被破坏，且使蛋白质失去其天然存在的四级结构、三级结构或二级结构。在某些实施例中，上述的变性还原处理包括如下操作：向酶切片段中加入盐酸胍和二硫苏糖醇，在50℃下进行变性还原。在某些实施例中，上述的变性还原处理包括如下操作：向酶切片段中加入表面活性剂和二硫苏糖醇，在95℃下进行变性还原。

本发明所述“去糖基化修饰”处理是指采用适当方法对蛋白中的糖基化修饰进行去除的处理；优选地，所述去糖基化修饰是指除去蛋白中的N-糖基化修饰；具体为采用去糖基化酶对酶切片段进行酶切处理，如N-糖酰胺酶F。